Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo
Özet
Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.
Abstract
Mitose ist entscheidend für organismal Wachstum und Differenzierung. Der Prozess ist sehr dynamisch und erfordert Ereignisse bestellt richtige Chromatin-Kondensation, Mikrotubuli-kinetochore Befestigung, Chromosomensegregation und Zytokinese in einem kleinen Zeitrahmen zu erreichen. Fehler in der heiklen Prozess kann in der menschlichen Krankheit, einschließlich Geburtsschäden und Krebs führen. Traditionelle Ansätze menschlicher Zustände mitotischen Krankheit untersuchen verlassen sich oft auf Zellkultursysteme, die die natürliche Physiologie und Entwicklungs / gewebespezifischen Kontext vorteilhaft fehlt, wenn die menschliche Krankheit zu studieren. Dieses Protokoll überwindet viele Hindernisse, die durch einen Weg, um sichtbar zu machen, mit hoher Auflösung, Chromosomendynamik in einem Wirbeltier-System, das Zebrafisch. Dieses Protokoll wird ausführlich ein Ansatz, der verwendet werden kann , dynamische Bilder von sich teilenden Zellen zu erhalten, die Folgendes umfassen: In – vitro – Transkription, Zebrabärbling Zucht / Sammeln, Embryo Einbettung und Zeitraffer-Bildgebung. Optimierung und modifikationen dieses Protokolls werden ebenfalls untersucht. Mit H2A.F / Z-EGFP (Etiketten Chromatin) und mCherry-CAAX (Etiketten Zellmembran) mRNA-injizierten Embryonen, die Mitose in AB – Wildtyp, auroraB hi1045 und ESCO2 hi2865 Mutante Zebrabärbling visualisiert. Hochauflösende Live-Bildgebung in Zebrabärbling ermöglicht eine mehrere Mitosen zu beobachten, statistisch zu mitotischen Defekten und den Zeitpunkt der mitotischen Progression zu quantifizieren. Darüber hinaus Beobachtung der qualitativen Aspekte , die unsachgemäß mitotische Prozesse definieren (dh congression Defekte, missegregation der Chromosomen, etc.) und falsche Chromosomen Ergebnisse (dh Aneuploidie, Polyploidie, Mikronuklei, etc.) beachtet werden . Dieser Assay kann zur Beobachtung der Gewebedifferenzierung / Entwicklung angewendet werden und ist zugänglich für die Verwendung von mutierten Zebrafisch und pharmakologischen Mitteln. Visualisierung, wie Mängel in der Mitose zu Krebs und Entwicklungsstörungen führen wird starkVerständnis der Pathogenese der Krankheit zu verbessern.
Introduction
Mitose ist ein wichtiger zellulärer Prozess essentiell für das Wachstum, Differenzierung und Regeneration in einem lebenden Organismus. Von der genauen Zubereitung und Replikation von DNA in der Interphase, wird die Zelle zu unterteilen grundiert. Die erste Phase der Mitose Prophase, wird durch die Aktivierung von Cyclin B / Cdk1 eingeleitet. Prophase wird durch Kondensation von Chromatin Material in Chromosomen charakterisiert. Kernhülle Schlag erfolgt am Übergang zwischen der Prophase und Prometaphase. In Prometaphase, Zentrosomen, die Keimzentrum für Spindelbildung, beginnen zu entgegengesetzten Polen während Verlängerung Mikrotubuli auf der Suche nach kinetochore Anlage zu migrieren. Nach Befestigung, bis Ende auf Conversions Mikrotubuli Befestigung und Spannungskräfte orientieren die Chromosomen eine Metaphaseplatte 1 bildet. Wenn alle Chromosomen korrekt, wird die Spindelanordnung Kontrollpunkt zufrieden, cohesin Ringe halten die Schwesterchromatiden zusammen gespalten gebunden sind, und Mikrotubuli verkürzen Schwester zu ziehenChromatiden zu entgegengesetzten Polen während der Anaphase 2,3. Die letzte Phase, Telophase beinhaltet Dehnung der Zelle und Rückbildung der Kernhülle um die beiden neuen Kernen. Zytokinese vervollständigt den Teilungsprozess durch das Zytoplasma der beiden neuen Tochterzellen 4-6 trennt. Änderung der Schlüssel mitotischen Wege (dh Spindelanordnung Kontrollpunkt, Zentrosom Vervielfältigung, Schwester-Kohäsion, usw.) Kann in der Metaphase Verhaftung missegregation von Chromosomen führen, und genomische Instabilität 7-10. Letztlich können Defekte in Wege steuern Mitose verursachen Entwicklungsstörungen und Krebs, erfordert die Visualisierung von Mitose und ihre Mängel in einem Live, Wirbel mehrzelligen Organismus 16.10.
Zebrabärbling-Embryonen dienen als große Modellorganismus für die Live-Darstellung aufgrund des transparenten Gewebe, einfache Mikroinjektion und schnelle Entwicklung. Mit Zebrabärbling, ist das übergeordnete Ziel dieses Manuskriptein Verfahren der lebenden 5D (Abmessung X, Y, Z, Zeit und Wellenlänge) Abbilden von Mitose 17 (1C) beschreiben. Die Verwendung von Mutanten Zebrabärbling defekt in verschiedenen mitotischen Bahnen zeigen die Folge solcher Defekte. Für dieses Protokoll, Aurora B und ESCO2 Mutanten wurden diese Mängel zu illustrieren gewählt. Aurora B ist eine Kinase, die ein Teil des Chromosoms Fahrgast Komplex (CPC), die zur Spindelbildung und Mikrotubuli Befestigungs ist. Es ist auch für Spaltungsfurche Bildung in Zytokinese 18,19 erforderlich. In Zebrabärbling führt Aurora – B – Mangel zu Defekten in Furche Induktion, Zytokinese und Chromosomensegregation 20. ESCO2, andererseits ist eine Acetyltransferase, die Schwester – Chromatid – Kohäsions 21,22 wesentlich ist. Es acetyliert cohesin auf dem SMC3 Abschnitt des Rings so cohesin 23 korrekte Chromosomensegregation in der Metaphase-Anaphase Übergang zu gewährleisten stabilisieren. Der Verlust der ESCO2 in Zebrabärbling führt zu chromosome missegregation, vorzeitige Trennung der Schwesterchromatiden, genomische Instabilität und p53-abhängige und unabhängige Apoptose 24,25. Aufgrund der Verfügbarkeit, auroraB hi1045 und ESCO2 hi2865 mutant Zebrabärbling (nachfolgend als Aurb m / m und ESCO2 m / m, jeweils) werden verwendet , um 25-27 um diese Technik zu veranschaulichen.
Die Kopplung der konfokalen Mikroskopie mit Fluoreszenz-markierten Zellmaschinerie hat Forscher aktiviert Chromatin und Zellmembran Dynamik während der Mitose 25,28,29 visualisieren. Fluorescent-markierte Histone haben in der Vergangenheit verwendet wurden Chromatin sichtbar zu machen. Histone sind Kernproteine bestehen aus vier verschiedenen Paaren (H2A, H2B, H3 und H4), die für die Nukleosomenstruktur verantwortlich sind, die 30 Chromosomen komponiert. Während H2B ist wohl das am häufigsten verwendete Histon für fluoreszierende ProteineMaus und Zellkultur, die Verwendung von Histon 2A, Familie Z (H2A.F / Z) ist für den Einsatz in Zebrabärbling 31,32 gut bewährt. Concanavalin A und Casein – Kinase – 1-gamma beispielsweise lokalisiert auf der Zellmembran und haben in Visualisierung der Zellmembran in Seeigeln und drosophila 33,34 vorher wirksam erwiesen. Andere Studien haben gezeigt , dass die CAAX fluoreszierend-markierte Protein bezeichnet die Zellmembran und war erfolgreich in Zebrabärbling 31. CAAX ist ein Motiv, das durch post-translationale Modifikationsenzyme wie Farnesyltransferasen und geranylgeranyltransferases erkannt wird. Änderungen durch diese Enzyme verursachen Proteine membranassoziiertes zu werden, wodurch die Zellmembran Markierung 35.
Aufgrund der Vorbenutzung in Zebrabärbling, wählte dieses Protokoll H2A.F / Z und CAAX zu etikettieren Chromatin und die Zellmembran zu verwenden. Die Anwendung dieser Methode ermöglicht es dem Forscher Mitose auf Einzelzellebene zu überwachen einzelnen Chromosom zu beobachtenDynamik, sowie gleichzeitig mehrere Zellteilungen zu überwachen, die Gewebedifferenzierung und Entwicklung auswirken können. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Abbildung der Dynamik von Chromosomensegregation während der Mitose auf Einzelzellebene. Innerhalb dieses Manuskript, die Fähigkeit, mehrere mitotische Teilungen zu beobachten, Teilungszeit berechnen und die mitotische Phänotypen entziffern wird dargestellt und diskutiert werden. Durch die Verwendung dieser Parameter kann, physiologisch relevanten Daten durch mitotische Mängel betroffen mehrere Krankheitszustände gesammelt und angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung dieses Verfahrens ermöglicht eine Kernhülle Abbau, Bildung einer Metaphase Platte durch Mikrotubuli-kinetochore Anhänge und Segregation von Schwesterchromatiden zu schließen zwei neue Zellen in vivo zu bilden , und in einer zeitabhängigen Weise. Die Fähigkeit, die Mitose in Zebrabärbling zu beobachten ist vorteilhaft gegenüber fixierten Proben und Zellkultur-Systeme, da die Zellen in die natürliche Physiologie abgebildet wird, das Gewebe transparent ist, die für fluoreszierende Proteine…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).
Materials
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
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