Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.
המוח האנושי הוא איבר זוללי אנרגיה אנרגיה שמסתמכת בעיקר על גלוקוז כמקור דלק. גלוקוז catabolized ידי המיטוכונדריה במוח באמצעות הגליקוליזה, חומצה תלת-קרבוקסיליות (TCA) זירחון מחזור חמצוני (OXPHOS) מסלולים לייצר את האנרגיה בתאים בצורת אדנוזין אדנוזין (ATP). ירידת ערך של ייצור ATP במיטוכונדריה גורמת להפרעות המיטוכונדריה, המציגי קליני עם תסמינים נוירולוגיים myopathic בולטים. פגמים מיטוכונדריאלי נוכחים גם הפרעות התפתחותיות (הפרעת ספקטרום האוטיזם למשל) והפרעות ניווניות (למשל amyotrophic טרשת לרוחב, אלצהיימר ופרקינסון). לפיכך, יש התעניינות מוגברת בתחום לביצוע ניתוח 3D של מורפולוגיה המיטוכונדריה, מבנה והפצה הן לפי מדינות בריאות מחלה. מוח המורפולוגיה המיטוכונדריה היא מגוונת מאוד, עם כמה המיטוכונדריה במיוחד אלההאזור הסינפטי להיות בטווח של קוטר <200 ננומטר, שהוא מתחת לגבול הרזולוציה של מיקרוסקופ אור המסורתית. הבעת חלבון פלואורסצנטי ירוק mitochondrially במיקוד (GFP) במוח מגביר באופן ניכר את זיהוי organellar ידי מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, זה לא להתגבר על אילוצים על הרגישות של זיהוי של המיטוכונדריה בגודל קטן יחסית ללא oversaturating התמונות של המיטוכונדריה גדול בגודל. בעוד במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים סדרתי שימש בהצלחה לאפיין המיטוכונדריה ב הסינפסה העצבית, טכניקה זו היא מאוד זמן רב במיוחד כאשר משווים דגימות מרובות. מיקרוסקופיה אלקטרונים סורקים סדרה לחסום פנים (SBFSEM) הטכניקה כוללת בתהליך אוטומטי של חתך, בלוקי הדמיה של רכישת רקמות ונתונים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לבצע SBFSEM של אזור מוגדר מהמוח מכרסם לשחזר במהירות ולדמיין מורפולוגיה המיטוכונדריה. טק זהnique יכול לשמש גם כדי לספק מידע מדויק על מספר המיטוכונדריה, נפח, גודל והפצה באזור המוח מוגדר. מאז רזולוציית התמונה המתקבלת היא גבוהה (בדרך כלל פחות מ -10 ננומטר) פגמים מורפולוגיים ברוטו המיטוכונדריה יכול גם להתגלות.
המיטוכונדריה הם אברונים דינמיים אשר משנים את צורתם ומיקומם תלוי רמזים הסלולר וצרכימים, באינטראקציה הדוקה עם שלד תא תא, ובתגובה לאירועים סלולריים כמו זרמי סידן בנוירונים 1. המיטוכונדריה גם אינטראקציה עם אברונים תאיים אחרים למשל reticulum endoplasmic, אשר בתורו מסדיר הדינמיקה שלהם המטבוליזם 2. מורפולוגיה מיטוכונדריאלי מראה ההטרוגניות של סוגי תאים שונים כלומר. את הצורה של אברון משתנית צינורי לזה מורכב יריעות, צקי אליפסות 3. הוכח כי חלבוני מחזור היתוך וביקוע המיטוכונדרי יכולים לווסת את המיקום, גודל, צורה והפצה של המיטוכונדריה 4. יתר על כן, שינויים בצורת המיטוכונדריה המשויכים ניווניות של מערכת עצבים, פלסטיות עצבית, ניוון שרירים, איתות סידן, דור מיני חמצן תגובתי כמו גם תוחלת חיים ומות תא להפליל that תא ספציפי מורפולוגיה המיטוכונדריה היא קריטית לשמירה על תפקוד סלולארי רגיל 5-11.
פונקצית bioenergetic גדולה של המיטוכונדריה היא ליצור אדנוזין אדנוזין (ATP) על ידי ביצוע סדרה של תגובות מטבוליות שכוללות פירוט מלא של חומרי הזנה (גלוקוז כלומר, חומצות-שומן או אמינו חומצות) דרך מחזור TCA ו OXPHOS מסלולי 12. המוח האנושי מהווה רק 2% ממשקל הגוף אולם היא צורכת ~ 20% מהאנרגיה הכוללת המיוצר מה שהופך אותו באנרגיה מאוד תובעני איבר 13. לכן זה לא מפתיע כי תפקוד המיטוכונדריה בבני האדם מוביל למספר רב של ביטויי נוירולוגיות 14-17. מוטציות גנטיות רכיבי OXPHOS הפוגעות מובילים דור ATP להפרעות המיטוכונדריה 17,18, אשר הן קבוצה הטרוגנית קליני של הפרעות עם שכיחות של ~ 1: 5,000 אנשים, ואחד הגורם השכיח ביותר של מ 'פרעות etabolic אצל ילדים ומבוגרים. גירעון של ATP נגזרות המיטוכונדריה משפיע על מערכות איברים מרובות עם איברים בדרישת אנרגיה גבוהה כגון מוח, לב ושרירי שלד להיות מושפעים בעיקר בחולים אלו 14,17,18. בשנים האחרונות, מחקרים רבים סיפקו ראיות תפקוד המיטוכונדריה הן הפרעות התפתחותיות ו ניווניות 15-17,19,20. מאז המיטוכונדריה חיוני קריטיים להתפתחות המוח ותפקודו, קיים הכרח לפתח פרוטוקולים שיכולים לנתח שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריה מוח, מבנה, גודל, מספר והפצה תחת שני המדינות בריאות וחולות. מודלים עכבר עם חלבון פלואורסצנטי ירוק mitochondrially במיקוד (GFP) הופקו לדמיין תנועות המיטוכונדריה ולוקליזציה במוח 21,22. אמנם זה הוא כלי שימושי מאוד לבחון תנועתיות המיטוכונדריה והפצה כללית, ישנם כמה חסרונות אשר includדואר רזולוציה מוגבלת ורגישות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תכונות אלה מקשות לעקוב אחר המיטוכונדריה בגודל קטן יחסית. באופן דומה, מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכי סדר נוצל בהצלחה כדי להציג המיטוכונדריה הסינפטי 23, אך שיטה זו היא זמן רב מאוד. מורפולוגיה מיטוכונדריאלי ידועה להיות מאוד דינמי כפי שהם עוברים מחזורי ביקוע ואיחוי רציפים, וברוב התאים המיטוכונדריה לשמור על רשת מחוברת ביותר 24-26. נוירונים ביותר מקוטבים תאים דנדריטים עם מרובי אקסונים מורחבים, ואת המיטוכונדריה יוצר רשת רשתי המחובר בגוף התא ייתכן שיהיה צורך להפריד כפי שהם עושים את דרכם דרך neurites אלה (איור 1). זה עושה המיטוכונדריה המוח מאוד מגוונת בגודל ובצורה. לדוגמה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק לחסום פנים סדרתי (SBFSEM) טכניקה, צפינו בעבר כי ההבדל בהיקף או גודל mitochondr extrasynapticIA למיטוכונדריה נוכחים במסופים העצבים יכול להיות הרבה כמו שש עשר לקפל 27.
קיימות מספר גישות לביצוע נפח מנתח 28, הכולל TEM סעיף סדר 29, קלטת אוטומטית איסוף ultramicrotome 30 SEM, ממוקד אלומת יוני SEM 31, ו SBFSEM 32. ניתוח SBFSEM יש יתרונות בכך שהיא כוללת את הרזולוציה כדי לספק נתונים כמותיים על הצורה, גודל מורפולוגיים, הפצת מספר אברונים כגון המיטוכונדריה באזורים עד 1 מ"מ של המוח. המבצע הטכני הוא גם הכי פחות תובעני, עם רכישת נתונים וניתוח במסגרת היכולות של מעבדות ביולוגיות רבות שאין להן ניסיון EM קודם. הופעתו של מכשירים מסחריים להפקת תמונות בסעיף דמוי סדרתי עשתה ניתוח ultrastructural 3D של רקמות טכניקה שיגרתית, אשר נוסף מאפשרת ניתוח volumetric משוחד בצורה מהירה דיר 28 </sup>. SBFSEM תואר לראשונה והשתמש בתחום הנוירוביולוגיה בשנת 2004 32, על בסיס רעיון הוצג על ידי לייטון בשנת 1981 33. מחקרים רבים מאז הקים טכניקה זו ככלי מרכזי בניתוח שחזור של מעגלים עצביים 34. יתר על כן, עבור פרויקטים בקנה מידה הרבה יותר קטן, הוא מספק ניתוח שחזור לזהות אברונים הסלולר 27,35-39. מאז, התמונות רכשו נגזרות אלקטרוני פיזור בחזרה מתח נמוך, פרוטוקולים מכתימים חדשים המשלבים טכניקות מכתימות מתכות כבדות ידועות שונות פותחו כדי להגדיל את הרזולוציה 40.
במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול עבור ניצול הדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים 3D וניתוח נפח של המיטוכונדריה במוח מבוסס על שיטות שבעבר שימשו על ידינו ואחרים 38,39,41. השיטות שלאחר עיבוד רקמות משמש תוארו בעבר על ידי Deerinck ואח40.
המורכבות של מערכת העצבים מהוות אתגר משמעותי בשחזור כרך גדולה של רקמה וניתוח המורפולוגיה וההפצה של אברונים כגון המיטוכונדריה עם רזולוציה נאותה. מספר תאים כולל נוירונים, oligodendrocytes ו האסטרוציטים עם תהליכים רבים המורחבת בשלושה ממדים אינטראקציה בתוך רקמת המוח 43. מ?…
The authors have nothing to disclose.
We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).
C57BL/6J mice | Jackson laboratory | 664 | |
Isoflurane | VETone, tradename Fluriso | 501017 | |
Dissection tray | Fisher scientific | S65105 | |
Dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
Butterfly canula | Exel International | 26704 | |
Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
Filter (0.45 micron) | EMD Millipore | NC0813356 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
Vibratome sectioning system | Ted Pella Inc. | Vibratome 3000 | |
Sodium Cacodylate | EMS | 12300 | |
Tannic Acid | EMS | 21700 | |
Potassium Ferrocyanide | J.T. Baker | 14459-95-1 | |
Osmium Tetroxide 4% Solution | EMS | 19150 | |
Thiocarbohydrazide | EMS | 21900 | |
L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A93100 | |
Potassium Hydroxide | Acros Organics | 43731000 | |
Lead Nitrate | EMS | 17900 | |
EMbed-812 EMBEDDING KIT | EMS | 14120 | Contains Embed 812 resin, DDSA, NMA, and DMP-30. |
Glutaraldehyde 25% EM Grade | Polysciences Inc. | 1909 | |
Paraformaldehyde | EMS | 19202 | |
Uranyl Acetate | EMS | 22400 | |
Ethanol | EMS | 15055 | |
Propylene Oxide | EMS | 20400 | |
Embedding Mold | EMS | 70907 | |
Aluminum specimen pin | EMS | 70446 | |
Colloidal Silver Liquid | EMS | 12630 | |
Razor | EMS | 72000 | |
Super Glue (Loctite Gel Control) | Loctite | 234790 | Hardware/craft stores carry this item |
Conductive epoxy | Ted Pella Inc. | 16043 | |
Scanning electron microscope | Zeiss | Sigma VP | |
In chamber ultramicrotome for SEM | Gatan Inc. | 3View2 | Can be designed for other SEMs |
Trimming microscope for pin preparation | Gatan Inc. | supplied as part of 3View system | |
Low kV backscattered electron detector | Gatan Inc. | 3V-BSED | |
ImageJ/ Fiji processing package | ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 | http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf | |
http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |||
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf | |||
http://fiji.sc/TrakEM2 |