Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes e de curta duração em circulação. Eles são rapidamente recrutadas para os locais de infecção ou lesão, onde servem fagócitos como profissionais através de liberação de intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio, juntamente com grânulos contendo peptídeos antimicrobianos e proteases ^1. Durante o seu recrutamento, os neutrófilos são "preparada" por vários agentes, incluindo os produtos microbianos, quimioatractivos, e citocinas inflamatórias, resultando em funcionalidade de fagócitos marcadamente melhorada após a chegada ao sítio de inflamação ^2. Os mecanismos de escorvamento de neutrófilos têm sido extensivamente estudada in vitro ^3,4; No entanto, o controlo dinâmico do processo in vivo, não foi possível até à data.

Recentemente, tornou-se imagens intravital uma técnica importante para visualizar e quantificar a dinâmica de processos biológicos celulares em organismos vivos. IntraviTal imagem pode ser realizada por meio de microscopia de excitação de um fotão convencional (por exemplo, confocal) ou microscopia multifotônica aproxima ^5. Com o tempo, melhorias substanciais foram alcançados nesta técnica que permite maior resolução de imagem, profundidade de imagem melhorada, diminuiu photodamage tecidos e melhorada ^6,7 estabilização de imagem. Dada a sua capacidade única para permitir a visualização dinâmica da migração celular e interação ao longo do tempo, microscopia intravital tem sido amplamente aplicada a diversas áreas de estudo em imunologia ^8. imagens intravital permite imunologistas para melhor compreender e contextualizar as respostas imunes, tanto a nível celular e molecular em modelos animais vivos.

Os recentes avanços na transgênicos, bem como knock-in ratos repórter forneceram ferramentas úteis para o monitoramento dos comportamentos dinâmicos de neutrófilos em animais vivos. Lisozima M promotor-driven proteína verde fluorescente melhorada knock-inratos têm sido amplamente utilizados para caracterizar a motilidade de neutrófilos, monócitos e macrófagos, durante vários processos inflamatórios incluindo extravasamento, infecção bacteriana, e a inflamação estéril ^9-15. Além disso, os ratinhos transgénicos que expressam uma energia de ressonância de fluorescência de transferência biossensor citoplasmática foram empregues para estudar as actividades dos neutrófilos mitogénio quinase extracelular regulada e proteína quinase A dentro de intestino inflamado ^16. Um modelo murino com elevada especificidade para a expressão de fluorescência em neutrófilos é a knock-in rato Catchup, que produz a recombinase Cre, bem como a proteína fluorescente tdTomato, que por sua vez está acoplado a expressão de antigénio de linfócitos 6G (Ly6G) ^17. A visualização de neutrófilos Ly6G deficientes via este modelo tem demonstrado que estas células exercer funcionalidade normal numa variedade de contextos in vivo inflamatórias estéreis ou infecciosas em. camundongos transgênicos expressando o DsRed fluorescente protein gene sob o controlo do rato interleuikin-1β (IL-1β) promotor (pIL1-DsRed) ter sido utilizada para visualizar os comportamentos motilidade de células produtoras de IL-1 – Acredita-se que os neutrófilos, os monócitos inflamatórios, e macrófagos activados – emergente em pele inflamada ^18.

In vivo rotulagem pode servir como uma abordagem alternativa para a detecção de comportamentos celulares e moleculares de neutrófilos nos tecidos inflamados. Depois de injecção intravenosa de doses baixas de anticorpo monoclonal marcado por fluorescência anti-Gr-1 (Acm), a cascata de recrutamento de Gr-1 ⁺ neutrófilos foi visualizada em lesões da pele do rato infectados com Staphylococcus aureus ^19. Administração in vivo de conjugados contendo estreptavidina conjugados 705 pontos quânticos nm e mAb anti-Ly6G biotinilado rotular especificamente neutrófilos circulantes ^20. Além disso, a endocitose de tais conjugados em neutrophIL vesículas permite o acompanhamento do transporte de vesículas de alta velocidade em neutrófilos que migram para o interstício. In vivo, marcação com anticorpos de fluorescência conjugada contra a P-selectina Ligando-1 Glicoproteico (PSGL-1), L-selectina (CD62L), integrina αM (CD11b ) e quimioquina (motivo CXC) do receptor 2 (CXCR2) num modelo inflamatória induzida por TNFa tem elucidado os mecanismos de regulação em jogo durante a inflamação precoce ^21. neutrófilos polarizados sobressair urópodos PSGL-1-enriquecida para interagir com CD62L presente em plaquetas activadas, resultando na redistribuição de CD11b e CXCR2, receptores que dirigem a migração de neutrófilos e iniciam a inflamação.

IL-1β é um dos genes de assinatura que é elevado em neutrófilos sensibilizados ^22. Em ratinhos repórter pIL1-DsRed, DsRed sinais de fluorescência (isto é., A activação do promotor de IL-1β) correlacionam-se positivamente com a IL-1β expressão de ARNm e a produção de proteína IL-1β. <sup> 18 Para monitorar o processo de priming de neutrófilos, um método de microscopia intravital foi desenvolvido envolvendo a indução de inflamação da pele com oxazolona (OX) no modelo do rato pIL1-DsRed seguinte rotulagem in vivo de neutrófilos com Ly6G anti-mAb fluorescência conjugada. Através deste modelo, é possível estudar o comportamento e função de neutrófilos, preparadas em modelos animais de várias doenças e desordens.