イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

注：すべての動物の作業は、欧州連合（EU）指令63分の2011 / EUとドイツの動物保護法に従って行いました。プロトコルは、サンプルを撮像するために実装から、中断することなく続くことを意味します。実践的な経験に応じて、タイムラプス実験を開始するために、2〜3時間かかります。データ処理は、この時間の計算には含まれません。実験に必要なすべての材料は、補足文書として提供され、その開始前に必要とされる材料のチェックリストに記載されています。手順1、2、3と4の手順2、3、4の場合、プロトコルはまた、公式顕微鏡取扱説明書を参照してくださいの5中に粉末フリーの手袋を着用してください。 イメージング実験の前に1.準備作業蛍光ビーズ原液このプロトコルは、（赤色の発光蛍光色素で標識された）500または1000nmの直径のポリスチレンビーズを使用します。ビーズの希釈率は1：4、000まず、ボルテックスで1分間ビーズ原液。 ddH 2 Oを990μlのビーズを10μlを希釈4℃で暗所でのソリューションを保存し、この1使用：1：40でさらに希釈用原液として100希釈を。 試料室のためのソリューションを準備 100ミリリットルのビーカーミックスメチレンブルーせずにE3培地の38.2ミリリットル、10 mMのN個の -phenylthioureaの0.8ミリリットルと1ミリリットル0.4％MS-222で。後に試料室内に浮遊粉塵の小粒子または溶解していない結晶を避けるために、濾過E3媒体を使用することが有益です。 蛍光魚の胚の選択実験前の日では、蛍光タンパク質を発現する胚を準備します。右実験前、蛍光信号の望ましい強さのための蛍光ステレオスコープの下で胚を並べ替えます。 5-10健全な胚を取り出し、ピンセットを使用してそれらをdechorionate。 注：このプロトコルは、16から72時間の古いために最適化され胚。 2.試料室の設定スリー商工会議所のWindowsの組み立て （厚さ0.17ミリメートル選択直径18mm）試料室4のウィンドウ、目的のための1つの三カバースリップで密封することがあります。 70％エタノールでこれらのカバースリップを保管してください。エーテルで使用する前に、きれいにそれらをワイプ：エタノール（1：4）。 細かい鉗子を使用してウィンドウにカバースリップを挿入し、それが最小の溝に入っていることを確認します。 17ミリメートルの直径のゴム製のOリングでそれをカバーし、チャンバー窓ツールを用いた照明アダプタリングにねじ込みます。他の二つのウィンドウのためのプロセスを繰り返します。 残りの商工会議所のパーツの取り付けチャンバーの第残りの側に適切な目的のためのアダプターをねじ込みます。アダプターの中央に直径15mmのOリングを挿入します。 茶中の右下の開口部に白のルアーロックアダプターにねじ込みmberと左上開口部の灰色のドレインコネクタ。黒ブラインドプラグが付いている3つのすべての残りの開口部をブロックします。 ペルチェブロックと六角レンチを用いてチャンバの金属ダブテールスライド底部を取り付けます。ルアーロックアダプタに50ミリリットルの注射器でホースを取り付けます。チャンバー内に温度プローブを挿入します。 顕微鏡に目標と商工会議所の挿入すべての目標はきれいでステレオスコープの下で確認してください。 10X / 0.2照明の目標と計画-アポクロマート20X / 1.0 W検出目的を使用し、その屈折率補正カラーは水が1.33に設定されていることを確認します。覆われた照明の目標を維持しながら、顕微鏡に検出目標をねじ込みます。 照明の目的をカバーするプラスチック製の保護キャップを取り外してください。注意深く顕微鏡にチャンバーをスライドさせて固定しているネジでそれを締めます。 温度プロを接続します顕微鏡でペルチェブロックであると。 注：ペルチェブロックの冷却液を循環させる2つの管は、両方のコネクタと互換性があります。それらにかかわらず、接続の方向の機能回路を形成します。 室の窓の上端までのステップ1.2で調製した溶液にシリンジを介してチャンバを埋めます。チャンバが漏れていないか確認してください。 顕微鏡、インキュベーションおよび制御およびストレージコンピュータを起動します。顕微鏡操作ソフトウェアを起動し、28.5℃のインキュベーション温度を設定します。 注：それは完全に平衡に1時間かかります。その間にサンプルを準備します。 3.サンプルの調製アガロースミックスの準備アガロース混合物の製造前に、15分、70℃に設定した加熱ブロックに（E3培地に溶解）を1％低融点アガロースの1ml量を溶かします。アガロースが完全にモルになると10、E3培地250μlの0.4％MS-222を50μlとボルテックスビーズストック溶液25μlを追加し、新しい1.5mlチューブに600μlのを転送します。 注：追加の75μlのは、胚と後で一緒に添加される液体のために計算されている。これは、ミックスの925μLを作ります。 38-40°Cで第2の加熱ブロックにチューブを維持またはアガロースがそれにサンプル胚を入れる前に、そのゲル化点に非常に近いことを確認してください。 胚をマウントします （〜1ミリメートル、内径、ブラックマーク付き）20μl容量の5ガラスキャピラリーを取り、それらに一致するテフロン先端プランジャを挿入します。テフロン先端がキャピラリーの底にあるように、毛細管を通してプランジャーを押してください。 ボルテックス37°C暖かいアガロースミックスのチューブにガラスやプラスチックピペットを用いて転送5胚（一度に取り付けることができる番号）。 注：液体一緒にウィットの最小体積をキャリーオーバーしてみてください時間の胚。 ミックスにキャピラリを挿入し、プランジャーを引き上げによって内部1胚を吸います。胚の頭部が尾前毛細血管に入ることを確認してください。プランジ​​ャと試料との間の気泡を避けてください。アガロース胚上記の±2 cmであり、その下の±1センチメートルがあるはずです。残りの胚について繰り返します。 アガロースが完全に固化するまで数分以内に起こる、待ってから、粘土やテープを入れたビーカーの壁にそれらを貼り付けることで、E3培地でサンプルを格納。キャピラリーの底部開口部は、サンプルへのガス交換を可能にする溶液中で自由にぶら下がってされるべきです。 注：セクション3.1および3.2と同様のプロトコルもOpenSPIM wikiページのhttp://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparationで見つけることができます。 4.サンプルポジショニングサンプルホルダ・アセンブリ正しいサイズの2プラスチック製スリーブ（黒）を挿入サンプルホルダーステムに互いに反対。そのスリット辺が外側に直面しなければなりません。それに2-3ラウンドを回して緩くクランプネジを取り付けます。クランプネジを介してキャピラリを挿入し、黒色のバンドは他の側に見えるようになるまで、ホルダーを介して、それを押してください。プランジ​​ャーを触れないようにしてください。 クランプネジを締めます。キャピラリーの外胚以下アガロースの過剰1cmにプッシュし、それをカット。試料ホルダーのディスクにステムを挿入します。 顕微鏡ステージがロード位置にあることをソフトウェアで確認します。顕微鏡に垂直下方サンプルと全体ホルダーを滑空する案内レールを使用してください。そのため、磁気ホルダーディスクロックの位置に、それを回します。 キャピラリーの検索これからは、ソフトウェアによってサンプルの位置を制御します。 探しタブで見つけ毛細管オプションを選択し、ちょうど検出オブジェクトの上に焦点にxの毛細血管、yおよびzを配置アイブレンズ。指導のための検体ナビゲータでグラフィカルな表現を使用してください。 それは、検出目的の瞳の前にあるまで、キャピラリーの外に静かに胚を押してください。 注：「見つけキャピラリー」は、顕微鏡の上蓋が開かれるべきであり、試料が押し出される時に、残りのプロトコル、で唯一のステップです。 サンプルの検索 「サンプルを見つけ 'オプションに切り替え、0.5ズームで視野の中心にゼブラフィッシュアイをもたらします。それは目に到達する前にシート光が試料の任意の高屈折率または吸収部を通過しないように、胚を回転させます。同様に、放出される蛍光は、試料のうち明確なパスが必要です。 「設定ホームポジション」をクリックします。 顕微鏡のフロントドアを開き、蒸発を避けるために、チャンバーの上部に3mmの開口部を有するプラスチック製のカバーを置きます。 注：液面が下回る場合イメージングレベルは、実験が損なわれることになります。 全体的な健康のためのプロキシとして胚の心拍を確認してください。それは遅すぎる場合は、別のサンプルを使用します（非装着され、コントロールと比較し、特定の値は、発達段階に依存）。最終的なズーム設定に切り替えて、胚の位置を再調整します。 5.多次元の取得を設定します取得パラメータ 「買収」タブに切り替えます。レーザーライン、検出目的、レーザーブロッキングフィルタ、ビームスプリッタやカメラなどの光パスを定義します。 ピボットスキャン]チェックボックスを有効にします。ビット深度、画像フォーマット、光シートの厚さのような他の取得設定を定義し、片面照明を選択します。 プレス '連続'とレーザパワーとカメラの露光時間を変更して得られた画像の輝度に応じました。 注：すべての画像化の設定を調整するためのレを使用試料への不要な光損傷を避けるために、実際の実験よりもレーザー出力（100mWのレーザーの0.5％、30ミリ秒の露光時間）。 光シート調整 「両面イルミネーション」とに切り替え 「オンラインデュアルサイドFusio'nチェックボックスを有効にしてください。 「Lightsheet自動調整ウィザード」を起動します。ステップの指示のステップに従ってください。 注：このウィザードは、検出目的の焦点面に光シートを移動させ、それが傾いていないことを保証し、その腰には視野の中​​心です。自動調整を終えた後、左右の光シートの位置が自動的にソフトウェア更新されます。画質の改善が現在明らかです。 「Z-スタック」チェックボックスを有効にします。 XZとYZオルトビューで蛍光ビーズで与えられる点広がり関数（PSF）の対称性を検査することにより、光シート調整を確認してください。それはノーである場合トンの対称は、手動で上下対称の砂時計形のPSF（ 図1A）を達成するまで光シートのパラメータの位置を調整します。 多次元取得の設定 「最初のスライス」と「最後のスライス」オプションを使用して、zスタックを定義し、1ミクロンへのzステップを設定します。 注：この顕微鏡の光シートは、静的であり、zの切片を介して試料を移動させることによって達成されます。常に「連続駆動 'オプションは、zスタックの速い獲得のために使用します。 「時系列」チェックボックスを有効にします。時点の数と、それらの間で間隔を定義します。 「マルチビュー」チェックボックスを有効にします。 X、Y、Zと角度情報が格納されているマルチビューリスト、に現在のビューを追加します。キャピラリーを回転させて他の所望のビューを定義するためにステージコントローラを使用してください。各ビューでzスタックを設定し、マルチビューリストに追加します。 注記：画像が取得されている間に、毛細管は、一方向になっているように、ソフトウェアは、シリアル方式でビューをソートします。 ドリフト補正と実験を開始セットアップ買収が完了すると、実際の実験を開始する前に15〜30分間待ってください。 注：サンプルは、最初のx、y、zのに数μmを漂うが、30分以内に停止する必要があります。サンプルが長いために漂流し続ける場合は、別のサンプルまたは再マウントを使用しています。 「メンテナンス」タブに切り替え、「ストリーミング」オプションで各ビューし、チャンネルの時点または個別のファイルごとに1つのファイル、 例えば 、データを保存する方法を定義します。プレス '実験を開始します」とファイル名、それは保存する場所とファイル形式（使用.czi）を定義し、戻って「取得」タブに移動します。 すべてが完璧に動作していることを確認するために、最初の時点の取得を確認します。すぐに登録を進めますそしてステップ6及び7に記載のように、第1の時点の融合、データセット全体を処理することが可能となることを確認します。 6.マルチビュー登録マルチビュー復興アプリケーションイメージングセッションの終了時に、データ処理用コンピュータに顕微鏡でデータストレージコンピュータからデータを転送します。 「マルチビューを使用します ReconstructionApplication「20,21,31は、データ処理のためのフィジー32（ 図1B）に実装されています。 データセットを定義します。 更新フィジー：フィジー>ヘルプ>アップデートのImageJとフィジー>ヘルプ>フィジーを更新します。メインのImageJとフィジー更新サイトを使用してください。 一つのフォルダにデータセット全体を転送します。処理の結果と中間ファイルがこのフォルダに保存されます。フィジー>プラグイン>マルチビュー復興> Multivi：マルチビュー復興アプリケーションを起動します。EW復興アプリケーション。 「新しいデータセットを定義する」を選択します。データセットの種類としてはMEUオプション」ツァイスLightsheet Z.1データセット（LOCI Bioformats）」を選択し、.xmlファイルの名前を作成します。その後、データセット（インデックスなしつまりファイル）の最初の.cziファイルを選択します。なお、画像データだけでなく、記録のメタデータが含まれます。 注：プログラムが最初.cziファイルを開くと、メタデータがプログラムにロードされます。 アングル、チャンネル、イルミネーションの数ていることを確認し、メタデータからボクセルサイズを観察します。フィジーのエラーメッセージの表示、処理およびその結果、「ViewSetupエクスプローラー'とコンソールの進捗状況を示す、ログウィンドウ：[OK]を押すと、開いている3つの別々のウィンドウ（ 図1C）を観察。 注：「ViewSetup Explorerは、「各ビュー、チャンネルや照明を示しているとの選択を可能にするユーザーフレンドリーなインターフェイスであります興味のあるファイル。さらに、「ViewSetup Explorerは、「すべての処理ステップのステアリングを可能にします。 処理する必要のあるファイルを選択し、エクスプローラの中にマウスの右ボタンを押してください。異なる処理ステップ（ 図1C）で開いているウィンドウを観察します。 データセットを定義する際に、データのフォルダ内の.xmlファイルが作成されていることを確認します。 注：このファイルは、以前に確認されたメタデータが含まれています。 右上の二つのボタンは、 'info'を観察し、「保存」。 「情報」を押すと、.xmlファイルの内容の要約が表示されます。 「保存」を押すと、処理結果を保存します。 注：「マルチビュー復興アプリケーション」で処理している間に別の処理ステップは、フィジーを閉じる前に、.xmlファイルに保存する必要があります。 OAD / 53966 / 53966fig1.jpg "/> 図1：マルチビュー復興ワークフローと関心点検出蛍光ビーズイメージングに基づいて（A）ライトシート整合。ビーズの画像は、XZ及びYZ突起対称砂時計形状を有する場合、システムは、（中心）位置合わせされます。いずれかの方向にずれて光シートの例には、左と右に示されています。 XZで500 nmのビーズの最大強度投影は、YZとXY軸が示されています。 lightsheetが正しく調整不良の状況に比べて整列されたときにサイドローブへ（XYで）エアリーディスクの中心ピークの強度の比が、大きくなることに注意してください。画像は0.7ズームで20X / 1.0 Wの目的で撮影しました。スケールバーは5μmで表します。 （B）のデータセットを定義し、その後HDF5形式に再保存されています。ビーズは、セグメント化され、その後、登録されています。時系列の各時点を基準時点に登録されています。データは、最終的に融合されています単一等方性ボリューム。 （C、トップ）ViewSetup Explorerは 、データセットの異なる時間点、角度、チャネルおよび照明側面を示しています。 （Cは 、下の隅を左）BigDataViewerウィンドウがViewSetupエクスプローラで選択された図を示しています。 ViewSetupエクスプローラに（C、右中） を右クリックして、処理オプションを開きます。 （Cは 、右下隅）進捗状況や処理結果がログファイルに表示されます。 （DおよびE）の検出の目的は、ここでは、対話型ビーズセグメンテーションからのスクリーンショットのように示すことが可能である試料中のわずかの検出とセグメントとして多くの関心点（ビーズ）にあります。 （DとE、左上隅）セグメント化は二つのパラメータ、 シグマ1およびスレッシュホールドのための違い-のガウス値によって定義されています。（D）が正しく検出されたビーズの拡大図で成功検出例。あまりにも多くの偽陽性および単一のビーズの複数の検出と（E）セグメンテーション。 （C）中のスケールバーは50μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 HDF5形式でデータセットを再保存データセット全体を再保存するには、Ctrl /アップル+ aと、右クリックですべてのファイルを選択します。その後、 再保存データセットを選択し、HDF5など 。 ウィンドウには、現在のデータセットのすべてのビューが再保存される警告表示が表示されます。 [ はい ]を押します。 注：このプログラムは、すべてのファイルを開くとHDF5形式の異なる解像度レベルを再保存することにより、HDF5する.cziファイルを再保存していきます。これは、完了時に「行って」で確認します。 usuall再保存yは、時点ごとに数分かかります（ 表1参照）。 注：HDF5形式のファイルは非常に高速にロードすることができますので、エクスプローラに「右クリック」とトグル」（オン/オフ）BigDataViewerの表示」で登録されていないデータセットを表示することが可能になりました。 BigDataViewerウィンドウが選択されたビュー（ 図1C）が表示されます。 BigDataViewer 33のコア機能は、 表2で説明しhttp://fiji.sc/BigDataViewerされます。 関心点を検出 特徴点を検出し選択するには、Ctrl /アップル+ Aですべての時間ポイントを選択し、右クリックします。 差のガウス 34 関心点検出のタイプのを選択します。ビーズベースの登録は、ラベルの関心点のためにフィールドにタイプ「ビーズ」、ここで使用されているので。 「セグメンテーションの前に画像のダウンサンプリング」アクティブにします。 次のウィンドウで、DETを観察ection設定。 「サブピクセルローカライズ者用「3次元二次フィット」34とi'nterestポイントの指定」の「インタラクティブ」ビーズセグメンテーション用差のガウス値と半径を決定します。 「ダウンサンプルXY「使用」マッチZ解像度（以下ダウンサンプリング）」および「ダウンサンプルZ 'の使用1×ください。 zのステップサイズは、従って、単​​にダウンZ分解能が十分であると一致するように、XYサンプリング、X-Yピクセルサイズよりも大きいです。 「CPU（JAVA）上の計算」を選択します。押して「OK」。 ポップアップウィンドウで、ドロップダウンメニューからパラメータをテストするための1つのビューを選択します。ビューがロードされると、フィジー>イメージ>調整>明るさ/コントラストまたはCtrl + Shiftキー+ Cでダニとビーズ検出用のボックス」の最大値のための外観（緑）」ウィンドウの明るさとコントラストを調整します。 aroun 'viewSetup」として緑色のリングにセグメンテーションを守ってD検出最小値のための最大値と赤を探していたとき。セグメンテーション、2つのパラメータ、 シグマ1用差のガウス値としきい値 （ 図1D）によって定義されています。セグメントのサンプルの周りなど、多くのビーズと（ 図1D）できるだけ試料内のわずか誤認検出にそれらを調整します。一度だけではなく、複数回（ 図1E）を各ビーズを検出します。最適なパラメータを決定した後、Enterキーを押して[完了します]。 注：検出時点の各個々のビューをロードし、ビーズをセグメント化することによって開始します。ログファイルでは、プログラムは、ビューごとに検出されたビーズの数を出力します。検出は、数秒で行われるべきである（ 表1参照）。 検出量が適切であるときにEnterキーを押して、（ビュー当たり数千600）を保存します。 注：フォルダには、情報が含まれているであろう、データディレクトリに作成されます検出されたビーズの座標についてのn。 インタレスト・ポイントを使用して登録 Ctrlキー/アップル+を持つ全ての時点を選択し、右側の「インタレスト・ポイントを使用して登録する」をクリックして選択します。 「登録アルゴリズム」などのビーズ検出のための「高速3D幾何学的ハッシング（回転不変） 'を使用します。 注：このアルゴリズムは、互いに対して異なるビューの向きや位置についての事前の知識を負いません。 お互いへのビューの登録については、「登録の種類」として「個別時点を登録する」を選択します。選択したチャンネルの「関心点」については、関心点のために以前に指定したラベルは、現在（ すなわち 「ビーズ」）を表示する必要があります。 次のウィンドウで、登録のための事前設定値を使用します。 「修正タイル：最初のタイルとバックマップしないでください使用を修正」を選択することにより、第1のビューを修正ゴマ場合（これを使用エスは、「タイルをバックマップ」セクションに）固定されていません。 「正則」と「アフィン変換モデル」を使用してください。 注：RANSACのための許容される誤差は5pxのであろうと、ディスクリプタ一致の重要性は、 ''正則」変換が10％剛性および90であることを意味し0.10のラムダ、と「剛体モデル」を使用してください10.になります％アフィン35。 OKを押して登録を開始します。 注：ログ・ウィンドウに表示されるように、最初の各ビューは、他のすべてのビューと一致しています。そして、ランダムサンプルコンセンサス（RANSAC）36は、対応をテストし、偽陽性を除外します。堅牢な登録のために、RANSAC値が90％よりも高くする必要があります。二面図の間で対応する真の候補の十分な数が発見された場合、変換モデルは、画素における平均変位に各マッチの間で計算されます。そして、反復グローバル最適化が行われ、すべてのビューされます固定ビューに登録されています。登録が成功すると、変換モデルが計算され、そのスケーリングおよびピクセルの変位で表示します。平均誤差は、最適に1ピクセル未満でなければならないし、1に近い転換登録のスケーリングが（ 表1参照）秒単位で実行されます。 サンプル、 例えば、細胞膜内の微細構造に観察されるように異なるビューの間にずれがないことを確認してください。その後の.xmlファイルにビューごとに変換を保存します。 注：今すぐ登録ビューがBigDataViewer（ 図2A）で互いに重複しているとビーズの画像も同様にオーバーレイされるべきである（ 図2B）。 それらの上で右クリックした時点を選択することによって変換を削除してから、変換を削除]を選択>最新/最新の変容。 2再 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 53966 / 53966fig2.jpg "/> 図2：マルチビュー再構成の結果 （A）は 、それらの間の重複を示すために異なる色でそれぞれ、登録されたビューをオーバーレイさ。 （B）は、異なるビューから撮像ビーズのPSFの重なりを示す図に拡大します。融合後のビーズのアップを閉じる（C）は 、PSFは異なるビューの平均です。 PSFは一点に潰れることを示すマルチビューデコンボリューション後の（D）（C）と同じビーズのPSF。膜は、GFPはより深い組織におけるzにおける信号の劣化を示すで標識された眼胞の単一のビューの（E）のxy断面および（F）YZ断面。 （G）のxyセクションと少しdegraで約20度離れて4ビューの加重平均融 ​​合後の同じビューの（H）yz断面全体のDED XY解像度が、増加のz解像度。 （I）のxyセクションと解像度とXYであり、zの両方の信号のコントラストの有意な増加を示すマルチビューデコンボリューション後の同じデータの（J）YZ断面、。 （EJ）内の画像は、単一の光のスライスです。スケールバーは50μmで（A、B、EJ）および10ミクロン（C、D）を表し、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 タイムラプス登録全体の時間の経過を選択し、右の時間をかけてタイムラプスを安定化させるために「インタレスト・ポイント使用して登録を」をクリックして選択します。 では「基本登録パラメータウィンドウ登録のタイプごとに1つの基準時点に対するマッチ（なしグローバル最適化）を選択します」。柯EP tは 、彼の他の設定個々の時点の登録と同じ。 次には窓、時刻を選択する基準は、時間経過の途中で、典型的には、時刻として使​​用されます。各時点内の個々のビューがすでに互いの上に登録されているので、ボックスにチェックを入れ、「剛性単位として各時点を考えます」。 「ショーの時系列統計」のボックスにチェックを入れ。その他の登録パラメータが正則含む以前のように残ります。 [OK]を押します。 注：ログウィンドウでは、同じ出力は、個々の時点登録のように表示されます。個々の時点の登録が成功し、堅調に推移しました場合は、RANSACは今99から100までパーセントであり、平均値、最小値と最大誤差は、通常、1ピクセル以下です。先に進む前に、この登録を保存します。 7.マルチビューフュージョン注：登録手順から得られた変換は、複数のビューのうち融合等方性スタックを計算するために使用されます。このスタックヘクタールZ間隔は現在XYにおける元の画素サイズと同じであるため、元のデータと比較してZスライスの数を増加させました。■。融合は、コンテンツベースのマルチビュー融合21,31または両方マルチビュー再構成アプリケーションに実装されているベイジアンベースのマルチビューデコンボリューション31のいずれかによって行うことができます。 バウンディングボックス注：フュージョンは計算コストの高いプロセスである（ 表1参照）、このように境界ボックスを定義することによって、データ量を削減することはかなりの処理速度を増大させます。 全ての時点を選択し、右クリックして、「バウンディングボックス」を定義を選択します。 「BigDataViewerで定義 'を使用し、バウンディングボックスの名前を選択します。 関心領域を決定した後、「OK」を押して、すべての軸に「分」と「最大」のためのスライダーを移動します。バウンディングボックスのパラメータが表示されます。 注：バウンディングボックスは内のすべてのものが含まれています透明マゼンタ層に重ねられる緑色のボックス。 コンテンツベースマルチビューフュージョン注：コンテンツベースのマルチビューの融合21の代わりに、単純な平均を使用してのより良い画質のために、より高い重みを考慮にスタックの上の画質の差（Zにおける信号のすなわち劣化）を取り、適用されます。 「ViewSetupエクスプローラー」に融合されるべき時点（複数可）を選択し、右クリックして、「イメージフュージョン/デコンボリューション」を選択します。 画像フュージョンウィンドウで、ドロップダウンメニューから「加重平均融合」を選択し、[選択した境界ボックス用に事前定義された境界ボックスを使用してください」。融合された画像の出力のために選択し、すでにHDF5既存のファイルに新しいHDF5ファイルを書き込み、一緒に登録された融合していない景色と融合された画像を使用することを可能にする、「現在のXMLプロジェクトに追加します」。押して「OK」。 そして、「事前定義バウンディングボックス＆＃で39;以前に定義されたバウンディングボックスの名前を選択し、ウィンドウをポップアップし、「OK」を押します。 次のウィンドウでバウンディングボックスのパラメータを確認します。迅速な融合のために、融合したデータセットにダウンサンプリングを適用します。 注：融合スタックが一定のサイズを超えている場合、プログラムはより多くのメモリ効率的な「ImageLib2のcontaine'rを使用することをお勧めします。より大きなデータの処理を可能にする」PlanarImg（大画像、表示しやすい）またはCellImg（大きな画像）」コンテナーへの「ArrayImg」から切り替えます。それ以外の場合は事前に定義された設定を使用すると「混合およびコンテンツベースの融合」を適用します。 「OK」を押して進んでください。 次のウィンドウにHDF5の設定を確認します。事前定義されたパラメータを使用して、融合プロセスを開始します。フィジーに十分なメモリが割り当てられていることを確認します [編集]> [オプション]>メモリ＆スレッド。 マルチビューデコンボリューション注：マルチビューデコンボリューション31は anotです多眼融合の彼女のタイプ。ここにさらに融合する、画像システムのPSFは、信号の画像および収量高解像度とコントラストをデコンボリューションするために考慮される（ 図2C-J、 図5及び映画3に比較して）。 デコンボリューションする時点（複数可）を選択し、右クリックを押して「画像融合/デコンボリューション」。 「マルチビューデコンボリューション」と使用」事前定義されたバウンディングボックスを、現在のXMLプロジェクトに追加」を選択します。バウンディングボックスを選択して続行します。 注：デコンボリューションのための事前定義されたパラメータは、良い出発点です。最初の試用'20の反復のために、デバッグモード ''と使用してデコンボリューションの影響を評価します」。最後に、512×512×512ブロック内への計算を設定します。 次のウィンドウでは、事前定義された設定を使用します。すべての5 '信奉結果を表示するには、「デバッグモード」を設定します配給」。 注：デコンボリューションの出力しかしBigDataViewerは現在、16ビットのデータをサポートする、32ビットのデータです。既存のHDF5データセットにデコンボリューションの出力を追加するためには、16ビットに変換する必要があります。 変換のために、実行 '（時間をかけて強度を飽和かもしれません）最初の画像の最小/最大を使用してください」。 注：デコンボリューションは、その後、画像をロードし、デコンボリューションのためにそれらを準備することによって開始されます。 BigDataServer 非常に大規模なXML / HDF5データセットを共有するために33 BigDataServer httpサーバを使用します。 http://fiji.sc/BigDataServerで発見することができますどのようにセットアップすると、サーバーへの接続をご紹介。 既存のBigDataServerオープンフィジー>プラグイン> BigDataViewer> BrowseBigDataServerに接続します。 ウィンドウにポートを含むURLを入力します。 注：この公報に記載の映画はこの広告を経由してアクセスできますドレス：http://opticcup.mpi-cbg.de:808​​5 利用可能な映画を選択することができますウィンドウを観察します。ダブルBigDataViewerウィンドウを開き、前述のようにデータを表示します。 補足：開始する前に必要とされる材料のチェックリストゼブラフィッシュの胚/蛍光タンパク質を発現する幼虫（メチレンブルーなしゼブラフィッシュE3培地中で胚を保管してください。ステージのために24時間以上経過は最終濃度0.2mMにPTUを追加することにより、色素沈着を打ち消します。） 蛍光ステレオスコープ毛細血管（ブラックマーク付き20μl容量）および適切なプランジャー（毛細血管を再使用しないでください。プランジャは、他の一方で、いくつかの実験のために再利用することができます。） 1.5ミリリットルプラスチックチューブ鋭いピンセットガラス（火研磨）やプラスチックピペット（プラスチックは24時間以前の胚のために使用することができます） ガラスやプラスチック皿、直径60ミリメートル（プラスチック製とすることができます24時間以前の胚のために使用されます） 2 100ミリリットルビーカー輸液150センチ延長ホースで50mlルアーロックシリンジ（ホースとシリンジは、微生物による汚染を避けるために、実験の間に完全に乾燥した状態で保管する必要があります。） プラスティシーン低融点（LMP）アガロース E3培地（5のNaCl、0.17のKCl、0.33mMのCaCl 2を、0.33 mMのMgSO 4）し MS-222（トリカイン） フェニルチオ尿素（PTU） （ここで、ビーズとも呼ばれる）、蛍光ミクロスフェア二重蒸留H 2 O（のddH 2 O）