Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.
Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions.
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.
形态是塑造胚胎和生长和分化驱动器一起从一个受精卵的个体发育成为成熟的多细胞生物体的过程。动物发育过程中形态方法可最好通过完整活标本1-3的成像进行分析。这是因为这种全胚胎成像保留所有驱动和调节发展包括信号分子的梯度,细胞外基质,脉管,神经支配以及周围组织的机械性能的部件。为了弥合的秤,在该形态出现时,快速亚细胞事件对整个组织在数小时或数天的发展的背景下一分钟的时间尺度被捕获。满足所有这些要求,正交平面照明显微镜5的现代执行4被开发。最初,它被命名为选择性平面照明显微镜(SPIM),4;现在是一个无所不包的长期轻质板材荧光显微镜(LSFM)通常使用。 LSFM使成像的高时间分辨率,同时诱发比激光扫描或旋转盘共焦显微镜6,7光毒性较少。如今,已经有基本光片照射原理许多实现,它已被用来对图像进行了大量的各种标本和过程以前无法进入的研究人员8-11。
我们首先要强调LSFM比传统激光共聚焦显微镜方法的几个关键优势:
获得从实时成像显微实验有意义的结果,重要的是观察仅最低限度地影响了标本。然而,许多生物,包括斑马鱼是激光照射非常敏感,使得它具有挑战性的图像它们与高时间分辨率共聚焦显微镜的光毒性无EFfects像停滞或延迟发育6,7。 LSFM目前与在样品7中的至少破坏性影响的荧光成像技术。由于薄激光光片照射是在特定的时间点拍摄的试样的仅一部分,光片显微镜是非常有效地利用光子。因此,低曝光允许健康样品的较长时间推移观察, 如 12-17。此外,由于LSFM的微创,获取的图像的数量不再受样品可以多少光耐受支配,而是由多少数据可以被处理和存储。
沿保持试样在接近生理条件的同一线,LSFM带有适合用于活胚胎替代样品放置策略。在LSFM技术中,将胚通常嵌入式低百分比琼脂糖的薄柱内。该mountin克到琼脂糖气缸允许旋转的完全自由,因此,可以从完美的角度被观察的样本(在LSFM称为视图)和从几个视图同时。多视点成像和随后的多视角的融合是大的,散射的标本特别有益,并允许高,各向同性分辨率捕捉它们。其他可能的LSFM安装策略汇总可以在官方显微镜的操作手册中找到,由E.雷诺的书面实验室样品制备节。它是一个推荐的读取,特别是如果我们的目标是图像不同的样品与此处所述。
在LSFM图像采集是宽视场,摄像为主,而不是激光扫描共聚焦显微镜。这导致更高的信号对用于采集的图像的信噪比(SNR),并且可以非常快速(几十到几百帧每秒)。 LSFM的高灵敏度进一步使弱荧光SAMP成像莱斯,像在内源水平18,或在不久的将来表达的转录因子,使用CRISPR / Cas9内源性蛋白标记。高信噪比也是成功的下游图像分析非常重要。高速不仅需要捕捉快速内进程,同时也从图像速度不够快多视图整个胚胎。的多个视图的无缝融合才能实现,如果所观察到的现象不会获得从单独的视图来这些数Z图库的过程中改变。
LSFM的优点通常不会来在图像质量为代价。 LSFM的横向分辨率比共聚焦显微镜的分辨率略差。这是因为在LSFM使用的检测目标具有较低的数值孔径相比,在标准共焦设置水或硅浸入目标1.2-1.3(通常为1.0或更小)。另外,由于在LSFM宽场检测(艾比森针孔的CE),有相比共焦显微镜更失焦光。失焦光的量由光片厚度来确定。尽管如此,这些缺点是由在LSFM的更高的SNR补偿。在实践中,这导致相比例如纺丝圆盘共焦采集15类似质量的图像。因此,这使得能够像细胞膜或细胞核, 例如功能可靠提取,用于细胞谱系追踪15,19。
LSFM的轴向分辨率被确定,除了上述被检测,由光片的厚度。可以LSFM在某些情况下,轴向分辨率优于共焦显微镜的分辨率。首先,在分辨率的改善来当光片是比检测目标,这通常发生于具有低放大倍数的物镜成像大试样的轴向分辨率更薄。第二种方式,该LSFM如何ACHieve更好的轴向分辨率,是多视角的融合,其中,从不同的角度高XY分辨率的信息组合成一个图像堆栈。由此产生的合并协议栈具有各向同性分辨率接近分辨率的值在横向方向20,21。用于注册到对方这篇文章中所描述的多个视图的策略是基于使用荧光聚苯乙烯珠镶嵌在样品20,21周围的琼脂糖受托标记。
作为LSFM商品化的结果,该技术现在可以科学家22的一个广泛的社区。因此,写这个协议的动机是为了使这项技术访问缺乏LSFM实践经验发育生物学家,并得到这些科学家使用这种技术,他们的样品开始。我们的协议使用商用光片显微镜,这就构成了概念上简单的显微镜Ť帽子是操作方便。我们将另外要提到最近的其他协议与家庭建造LSFM设置,这可能是合适的回答具体问题23-25 成像斑马鱼。另一个进入选项LSFM是开放平台26,27,它们使用开放式访问原则,使轻质板材镜到更广泛的社区。在硬件和软件方面两者的文档可在http://openspim.org和https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/找到。
在这个协议中,我们使用了硬骨鱼斑马鱼作为模型系统来研究与LSFM发育过程。斑马鱼眼的形态是,强调许多LSFM的好处的例子。 LSFM已经过去用于研究眼球发育在青鳉28和在斑马鱼29,30。在眼睛发育的早期阶段它是复杂的定位正确胚胎传统显微镜,作为膨松蛋黄不允许胚胎趴在侧以其眼睛朝向目标。然而,随着LSFM安装到琼脂糖柱中,样品可以被再现地定位。此外,从视泡到视杯阶段的过渡过程中,眼睛经历伴随着增长,这需要捕捉大Z堆栈和视大领域的主要形态发生重排。也对这些挑战LSFM优于常规共焦成像。视杯的形成过程是三维的,因此它是很难理解,并从一个视图通过单独成像可视化。这使得具有各向同性分辨率成像多视点有利。视杯形成之后,视网膜变得激光曝光越来越敏感。因此,与LSFM相关联的低光毒性为长期成像的主要优点。
在这里,我们提出了一个优化的协议为一到三天的成像老斑马鱼胚胎一个第二幼虫集中在眼睛的发育。我们的方法可以覆盖多达12-14小时的高时空分辨率时间推移电影录音。重要的是,我们还显示了数据处理,这是在LSFM的必要步骤的流水线,因为这种技术必然产生大的数据集,常在TB的范围。
1.数据采集的关键步骤和故障排除
对于GFP和RFP表达样品的典型的成像设置可以在表3中所描述的显微镜设置的光片是静态的,由圆柱形透镜构成被发现。两个照明目标是空气透镜和检测目标是水浸渍镜片。缩小1.0 20X / 1.0或40X / 1.0目标给出了230 nm和115 nm的像素大小和分别来看441点¯x441微米或221点¯x221微米领域。建议使用默认的轻质板材厚度与中心边境比例为1:2。为20X / 1.0这个厚度相当于4.5微米,对于40X / 1.0至3.2微米的中心。如果成像速度不是主要的优先级,使用单独的轨道在一个多色样品的情况下,以避免信道之间的荧光发射的串扰。采集的最高速度由限制在50毫秒每ž步骤的z驱动器的移动速度。如果目标是达到最大成像速度的情况下, 例如 ,用双面照明两个轨道中,曝光时间必须被设置为使得每Ž步骤拍摄的所有图像的总和是低于50毫秒。另一方面,如果只有一个图像被每Ž步骤获得的,它不利于以设置曝光时间大于50毫秒短。
1920×1920的图像尺寸 |
16位 |
透视扫描上 |
双面光照在线融合 |
10X / 0.2照明目标 |
20X /为1.0W计划复消色差透镜探测目标 |
轨道1:激发488nm的通常为100毫瓦的激光的2%,550nm处的SP发射滤波器 |
轨道2:激发波长561%,一般为3毫瓦75激光585纳米LP发射滤光片 |
曝光时间长达100毫秒 |
ž堆栈厚度为50〜100μm |
1-1.5微米ž步长在连续Z驱动器模式 |
孵化在28.5℃, |
表3:成像设置。
实验后检查样品
以确保该样品仍处于实验结束健康是重要的。作为第一读出,检查体视下试样的心跳。具有一对锋利的镊子的样品可以取出琼脂糖并移至孵化器,以便检查它是否被受成像得到进一步发展。可替代地,它可以是固定的抗体染色。
安装和漂移
它保持室S的容积渗透摩尔浓度是必不可少olution接近嵌入琼脂糖的渗透压,否则肿胀/琼脂糖和将发生的样本随后不稳定的萎缩。因此,使用相同的解决方案(不亚甲蓝E3中),以填补室,并准备1%低熔点琼脂糖等分。另外,不要留在70℃加热块琼脂糖超过2小时,因为它可能会失去其胶凝性能。
不要嵌入鱼放入太热琼脂糖,因为这会导致胚胎的热休克反应或死亡。如果不确定温暖琼脂糖对胚胎的影响,检查尾不弯曲,而且心脏速度不会减慢。如果发生这种情况,使用不同的胚胎的实验。
保持琼脂糖柱的总长度与(厘米左右2)样品短和装入其头部朝向柱塞头定向的斑马鱼。同样地,琼脂糖气缸从capill挤出进制应保持尽可能短。这些措施将确保样品的稳定性在整个电影。与此同时,使玻璃毛细管本身不伸入光路中,因为这将引起重大的折射和反射的琼脂糖柱必须足够长。
样品的初始漂移是由琼脂糖汽缸本身的体积变化引起的。活塞滑动不是它的原因。因此,它不能帮助解决与橡皮泥或指甲油柱塞。胚胎可能会改变在影片中的位置因其自然增长了。因此,最好是中心的感兴趣的区域中的视场的中部,并保持一定的空间的边缘,以适应这些运动。
在光路灌封介质的减少量的
正确地定向样品有助于实现最佳的图像质量15。基因反弹,激发和发射光应该通过尽可能少的组织和安装介质尽可能出行。最优解是自由琼脂糖安装。这是在一个安装例如实现为拟南芥侧根摄像14中,其中主要的根被安装到植物凝胶和侧根随后让完全生长出的凝胶柱。免费琼脂糖安装也为赤甲虫的完整胚胎的成像开发的两天12。图像质量的改善是不是在这种情况下,一个主要动机。赤胚胎根本不琼脂糖里面存活足够长的时间。绝对嵌入自由媒体的安装还没有实现在斑马鱼长期成像。尽管如此,我们可以采取的事实,即当琼脂糖固化,大多数胚胎对角线与位于深处的琼脂糖一只眼睛和第二眼睛贴近嵌入柱的表面定位在毛细管中。 ŧ他眼靠近表面提供卓越的图像质量,因此,应该优先成像。
琼脂糖浓度与长期成像
琼脂糖的用于安装浓度是样品的稳定性,并容纳胚胎的生长和扩散的氧气给它的可能性之间的折衷。有样品的稳定性没有附加增益用琼脂糖浓度高于1%时。作为起点用于优化实验中,我们推荐0.6%琼脂糖,这也适用于过于娇嫩被安装到1%琼脂糖胚胎年龄小于24高倍视野。到麻醉年长胚胎和幼虫中,MS-222的浓度可以提高到为200μg/ ml的无副作用13。
万一显影胚成像长于±12小时,不推荐琼脂糖安装,因为它限制了胚胎和CAUS的生长ES尾部变形。此问题是由安装成胚胎FEP聚合物管具有类似折射率水13,39解决的斑马鱼。小鼠胚胎,另一方面,可以在中空琼脂糖缸40或附连到注射器41的丙烯酸杆的孔固定。 FEP管子安装不推荐为缺省方法,但因为该管的壁折射光比琼脂糖稍多。
光片对齐
为了获得良好的画质是每个实验前进行自动光片定位的关键。特别是如果将变焦设置被改变时,目标被取出,或者在室中使用不同的液体。
照明
光片的透视扫描应该总是被激活。对于大的散射标本,有必要与在线˚F应用双面照明延髓实现跨越视场均匀的照明。双面照明也削弱了眼成像,这是入射光片通过胚胎的透镜的折射的特定问题。更小,更散射试样可以使用单面照明,其通过半缩短成像时间,并可能导致略微更好的图像质量相比,双面照明被有效地成像。这是因为在两个照明臂的光路总是不同的,更有效的人可以被选择。另外,从每一侧来的两个光片是从未完全在一个平面上,这将导致轻微的融合后模糊。对于非常快速的细胞内事件,如生长微管( 电影2)时,双面照明是不恰当的,因为来自左和右与照明图像顺序,这可能导致的运动模糊被获取。
光漂白和光毒性
少荧光漂白被经常提到的LSFM的一大优势。我们会认为,目标应该是没有漂白的。如果在实时成像实验显漂白,试样可能已经出耐受激光曝光的其生理范围。当成像在旋转盘显微镜斑马鱼胚胎,根据我们的经验,高光毒性甚至可以在荧光信号明显漂白剂摊子前胚胎发育。因此,使得几乎没有或没有漂白观察在LSFM成像设置应进行调整。即使LSFM是平缓的样品,为谨慎起见,以使用根据需要来实现信噪比足够用于随后的数据分析仅作为多激光功率和曝光时间。
Z堆叠,时间间隔和数据大小
通过LSFM生成的文件通常都很大;有时在TB级范围内。它常常必须使图像质量和数据大小之间的折衷。特别是对于在时间推移采集栈和间隔中的Z间距的情况。定义的Z区间,在Z堆叠工具标签最优按钮应理想地使用,特别是如果数据集将在后面去卷积。它计算的间距,实现周边光切片之间重叠50%。尽管如此,稍大ž间隔通常是可以接受的。它们减少获得的Z堆叠以及最终文件大小所需的时间。的最佳时间取样取决于感兴趣的过程。对于整个眼睛发育5-10分钟的间隔通常是可以接受的。如果某些结构将被自动地跟踪,随后的时间点必须足够类似。
荧光珠
荧光珠主要作为基准标记用于注册不同的看法的多视点数据集到彼此。在使用前仔细始终涡珠的解决方案。不要加热珠粒,因为这可能会导致该荧光染料的损失。对多视点登记最优珠粒浓度必须通过实验确定。所描述的插件效果最好遍布每个视图约1000检测珠。大(500纳米或1000纳米)珠粒小于(小于500纳米)珠检测更加稳健。这是因为较大的珠是亮和更容易段而不与样品中的结构的假阳性检测。较大珠的缺点是,它们是在最后的熔融和反褶积图像非常突出。对于每个新的荧光标记物,合适的珠子尺寸和荧光发射必须进行优化。得到从图5和电影3样品的一个例子,100纳米的绿色发射的珠子,得到在膜-GFP通道太多假阳性检测,但1000Ñ与样品内很少阳性检测的H2B-RFP通道被鲁棒地探测米红色发射珠。如果胎圈检测与所述荧光标记物的信道出现故障时,只有包含珠的分离的通道能够获得,但是这不是很实用。子分辨率大小的珠子,得到显微镜的点扩散函数(PSF),它可以用于去卷积( 图2C-D)的直接读出。如果登记和融合工作与大珠( 例如 1000纳米)好,PSF的一个单独的图像可以用次分辨率, 例如 ,100纳米珠被收购。使用多色珠粒多信道采集的登记期间和验证该通道覆盖完全是有帮助的。
从未经随后的多视点配准和融合的单一视图成像时的荧光珠加成是没有必要的。然而,即使在这种情况下小珠可以是初始期间有帮助l光线表的调整来检查光片的质量和一般揭示光学像差。这样的光学像差可以从像损坏或弄脏目标,琼脂糖室或不均匀的窗户脏了各种的来源。珠也可以由多视点登记斐济插件20用于漂移校正。
多视点
对多视点重建目的,最好是获得一奇数的次3,5等,这是不彼此相对。由于专业服务公司是从不同方向拍摄这提高了反卷积。同样重要的是在时间推移采集的开始存在的视图之间足够的重叠进行确认。这最好凭经验完成, 也就是说 ,立即确认在第一时间点的观点,可以成功注册。当多视点采集的目标是要提高分辨率一个大的散射试样的图像的,它是不可取的图像中的每个视图整个标本,但阻止围绕样品,其中信号恶化的中心。从试样下半年的低质量的收购行动不会有用的信息给多视图重建的补充。
2.数据处理的关键步骤及故障排除
目前,存在从该是有据可查的,比较容易采用轻质板材镜多视点处理数据的几种可能性。我们使用多视点重建应用程序,这是斐济32(斯蒂芬Preibisch出版,实现了一个开源软件的链接1A和Link1b材料的列表)。这个插件是以前SPIM注册插件20的重大的重新设计,审查通过Schmied 等 42,集成了BigDataViewer和XML和HDF5格式33与SPIM登记工作流程( 图1B, 链接2 , 链接3 )。本申请还可以适于高性能计算集群,其中显著加快处理43。这多视点注册申请正在积极进一步发展,精益求精。在出现问题或功能要求所描述软件的情况下,请您到相应的页面GitHub的(问题链接4的多视点重建和链接5为BigDataViewer)。
第二个选择是与显微镜一起使用可用的商业软件。该解决方案运作良好,并采用使用荧光珠注册不同意见的原理一样。但是,它缺乏可视化整个数据集快似与BigDataViewer的选项。另外,软件不能适于群集并进一步处理块为其他用户,除非该软件附加许可购买显微镜。
第三种选择,这也是一个开源软件,最近被凯勒实验室44公布,并提供了处理和光表数据的下游分析的全面框架。该软件利用信息从样本内执行多视点图像融合,因此它不要求在样品周围荧光珠的存在。但同时它假定的成像视图(目标)正交的方向,因此它不能被用于从任意角度44获得的数据。
硬件要求
ntent“>用于处理的硬件可以在表4中找到。必须有足够的存储容量和可用的一个明确的管道进行数据处理,超前实际的实验。图像采集比随后的分析速度,很容易得到充斥着未处理的数据,这是往往是不现实的存储所有的原始图像,而是一个播种的版本或处理的图像,例如融合的观点,最大强度的预测或球形突出45。处理器 | 两个Intel Xeon处理器E5-2630(六核,2.30 GHz的涡轮增压,15 MB,7.2 GT /秒) |
记忆 | 128 GB(16×8 GB)1600 MHz的DDR3 ECC RDIMM |
硬盘 | 4×4 TB 3.5英寸串行ATA(7.200 RPM)硬盘驱动器 |
硬盘控制器 | PERC H310 SATA / SAS精读对于控制器戴尔Precision |
硬盘配置 | C1 SATA 3.5英寸,1-4硬盘驱动器 |
图像 | 双2 GB的NVIDIA Quadro 4000(2张卡W / 2个DP和1个DVI-I每个)(2 DP-DVI和2个DVI-VGA适配器)(MRGA17H) |
网络 | 英特尔X520-T2双端口10 GbE网络接口卡 |
表4:硬件要求。
数据处理速度
所需的数据处理的时间依赖于数据的尺寸和所使用的硬件。在表1中,我们提供的用于在处理与4次和2通道由1时间点的一个例子8.6 GB的多视点数据集的关键步骤所需要的时间的概述。
处理小号TEP | 时间 | 协议的步骤 |
作为重新保存HDF5 | 6分30秒 | 6.3 |
检测兴趣点 | 20秒 | 6.4 |
注册使用兴趣点 | 3秒 | 6.5 |
基于内容的多视角融合 | 4小时 | 7.2 |
多视点去卷积(CPU)的 | 8小时 | 7.3 |
多视点去卷积(GPU) | 2小时 | 7.3 |
表1:数据处理时间。
输入数据格式为多视点重建
斐济插件多视点重建可以支持.czi,.TIF和ome.tiff格式。由于.czi格式的数据结构的,不连续的数据集是不支持未经预处理。不连续意味着记录必须被重新启动( 例如 ,调整由于漂移样品的位置)。在这种情况下,.czi文件需要被重新保存作为.TIF。对于文件的.tif每个视图和照射方向需要被保存为独立的文件。
像素大小的校准
显微镜的操作系统软件计算用于基于所选择的目标在xy像素大小校准。然而,在z中的像素大小是由步长独立地限定。如果在软件中指定了错误的目标,在XY到Z的比例是不正确的注册将失败。
首次注册登记
定义数据集后注册数将是1和兴趣点的数量将在ViewSetup资源管理器为0。初始登记表示数据集的校准。无论是数量Ø˚F登记和兴趣点会在加工过程中增加。
向下采样检测的兴趣点
使用下采样建议,由于文件的装载和分割将会更快。值得注意的是,检测参数将根据下行采样发生变化,从而不同向下样本设置之间传送检测设置是不可能的是不过重要的。
兴趣点检测
这是明智的段在每个视图许多真正的珠可能,甚至在一些获取误报检测的价格,因为他们不妨碍登记增色不少。虚假检测,如果在几号,在注册过程中(见兴趣点注册)排除在外。然而,大量的假阳性检测姿势的算法的一个问题。它不仅降低性能,用于检测和登记,因为它需要更长的时间来分割图像以及在视图之间进行比较这些珠,但它也降低了登记的准确性。这可以通过使用更严格的检测参数来解决。此外,在珠粒( 即在一个胎圈图1E多次检测)分割是不利的注册,应该避免。
兴趣点报名
要注册到的意见彼此,在每个视图每个珠子的位置是由它的位置相对于它的三个最邻近珠介绍。这些星座都形成了局部几何描述,并允许比较视图之间每个珠子。然后用两种观点之间的匹配描述珠被视为候选人对应。注意,这仅适用于随机分布珠的量,局部描述符是通常对每个珠是唯一的。人们可以使用其他结构,如样品登记在细胞核。然而,为了检测核,其分布的非随机样品中,其它方法应用20,21。
候选的对应,然后针对RANSAC 36以排除假阳性测试。每个对应的提示进行叠加的看法上互相转换模型。真正的信件将在一个转型模式有可能达成一致,而离群将每个点一个不同的。那么真正的对应被用于计算两个被比较的视图之间的仿射变换模型。用一种迭代优化算法的全局优化 ,然后进行,在此期间,所有的视图被注册到具有最小位移的观点20,21之间的目标的第一个图。
时间推移注册
由于移动显微镜载物台的琼脂糖和不精确电机运动的彪,每个堆栈的位置随时间适度变化。而各个时间点的登记删除这个时间点的视图之间的差,所述时间推移也需要被登记为一个整体。为此目的,每个单独的时间点被登记到参考时间点。
参考时间点
如果有许多时间点的时间序列进行处理,有代表性的时间点从时间系列的中间选择作为参考,通常自胎圈强度可以随时间降解,由于漂白。在此参考,兴趣点检测,登记,边框和融合的参数才能确定。然后这些参数被应用到整个时间推移计算每个单独时间点的特定变换模型。在时间推移注册的所有其他时间点也REGIST空间ERED到这个参考时间点。因此,对于整个记录的边界框的参数取决于这特定时间点。
多通道注册
当成像多个通道,理想相同的荧光珠应在所有成像的频道可见。的检测和注册然后可以单独地每个通道,其中考虑到在转化的不同的光的波长的影响上进行。通常这是不可能的,因为珠子并非在所有的频道可见或珠粒主导图像中的一个信道太多,并且在其他信道(多个)太暗淡。典型的解决方案是仅在用于检测和登记所获取的变换模型中的一个信道以使用可见珠( 即检测后,登记和时间推移注册)然后通过斐济>插件>多视点Reconstr施加到其它通道,减税>批处理>工具>重复转换,在下拉菜单中选择申请一个 通道 转换 成其他渠道 。在下面的窗口中选择XML,然后单击确定 。然后选择包含珠源通道和目标通道选择无珠通道(S)的通道。 重复该转换使用更换所有的转换 ,然后按确定 。然后变换被复制到其他所有通道,并保存在XML 要看到ViewSetup资源管理器中新的变革,重新启动的MultiView重建中的应用。
边框
的多个视图融合在计算上是非常密集。然而,大图像通常是收购,以适应不只是样品,而且周围的珠子。一旦注册参数s的从珠粒中提取,它们是作为图像的一部分不再有用。因此,为了提高融合效率,只包含样本的图像栈的部分应熔合在一起。感兴趣(边界框)的区域应该被定义为包含样品和尽可能少的周边琼脂糖越好。对于图2中的实施例与2229×2136×2106像素的整个体积上的加权平均的融合将需要38196 MB的RAM,而用一个边界框的体积减小1634×1746×1632像素和存储器要求降低至17,729 MB。
基于内容的多视角融合
在融合多视点数据所面临的挑战是,通常的看法突然终止,并且不包含在同一像素相同的图像质量。因此,意见简单平均会导致混合文物和不必要的图像退化。基于内容的多视角福锡永取这两个问题考虑在内。首先,它融合了不同的视图,其中,一个图象结束,另一个开始,第二,它评估本地图像质量和在融合21到更高的图像质量施加较高的权重。相比于单一视图有决议Z中的改善与XY( 图2E-H,图5A-D)的信号略有下降。
多视点反褶积
多视点去卷积是另一种方式来实现的观点融合。用这种方法的不同视图还的PSF都考虑到为了恢复已卷积通过显微镜的光学系统的图像。此方法大大通过去除图像模糊和增加信号31( 图2C-D,图2I-J, 图5E-G, 电影3)的分辨率和对比度提高了图像质量。
ve_content“>解卷积的计算非常密集( 见表1),因此,使用用于处理GPU增加了这种过程的速度,也可能有必要对向下取样数据执行反卷积。为了向下样品,使用斐济>多视点重建>批处理>工具>应用转换 ,这将适用于将被保存在.xml文件的意见,一个新的转型模式。对于BigDataViewer和BigDataServer HDF5文件格式
该BigDataViewer 33允许TB级数据的方便的可视化。如何控制BigDataViewer总结于表2中 。该程序的基本操作的截屏,也可作为原文出版物33补充。该BigDataViewer集中在一个.xml文件,其中包含元数据,和一个HDF5文件,其中包含的图像数据。该图像数据是PRES耳鼻喉科在三维块多分辨率级别的HDF5。多重分辨率级别允许与较低的分辨率可视化数据的速度更快,以前全分辨率被加载。在需要时个别块只加载到内存中。因此,HDF5图像格式允许数据直接和快速的可视化通过BigDataViewer 33。由于文件的加载被更有效地进行,也加快了处理。因此,我们建议重新保存数据集到该格式,虽然它并不严格要求的处理。的数据格式的进一步的解释,请参阅链路3 。此外,该数据集可以与合作者或使用BigDataServer 33(公共共享链路6 )。
键 | <td> 效果|
F1 | 显示了与BigDataViewer的简要描述及其基本操作的说明 |
<>或鼠标滚轮 | 在Z轴运动 |
向上和向下箭头 | 放大和缩小 |
右键单击并拖动 | 在浏览器移动样本 |
左键单击并拖动 | 旋转样品光标周围 |
滑块观众或Tab键和左或右箭头的底部 | 在时间轴上移动 |
此外按下Shift | 沿任意轴快移动或旋转 |
x和再向左和向右箭头 | 绕x轴旋转 |
Y然后左,右箭头 | 绕y轴旋转 |
z和再左,右箭头 | 绕z轴线旋转 |
转变和X | 沿定向X轴的视图 |
转变和y | 沿定向y轴的视图 |
转变和z | 沿定向z轴视图 |
一世 | 不同的插值模式之间切换( 即近邻和三线性) |
s或设置>亮度和对比度 | 修改频道,亮度和对比度的彩色 |
F6或设置>公开性和分组 | 更改显示的群体,使分组通过数字键覆盖不同群体和呼叫组 |
F10或工具>录制电影 | 获取时间序列当前显示的切片的 |
表2:大数据查看器。
3.所述实施LSFM的局限性
低吞吐量
在一个典型的LSFM实验只有每个实验一个样本成像。不过,根据我们的经验,很多有用的信息可以从单个样本中提取。多个胚胎的高通量成像已建成的家设置LSFM在46-48样品定位和旋转的自由为代价最近取得,虽然一般。
渗透不足深入到组织
即使斑马鱼的胚胎是半透明,由于散射和吸收成像在组织更深时所获得的图象质量迅速恶化。部分,这是由样品所发射的荧光的散射和吸收的效果,并且不能在当前的设置进行校正。图像质量不均匀的另一个来源是不规则照明。 ŧ他光片是从左侧或右侧入射,并在它的路径折射它,这导致条纹伪影和模糊的任何对象。的双面照明和多视角的融合可以减少最终图像中的假象。最后,图像质量趋于朝向视场的边缘略差由于光片,其是变向边缘厚的自然几何形状。
有限公司化学处理
使用药物或抑制剂是在斑马鱼的研究普遍。在这种显微镜使用药物被限制,由于样品室和所述仪器中的其他用户,谁共享相同的腔室的考虑因素的大体积。使用专用药物实验额外室可以解决这个问题。用玻璃珠部分地填充腔室减少所需的液体的体积。
没有photomanipulation
柯伦TLY没有像光转化,或在这种显微镜激光烧蚀本地化光学操控的可能性。尽管如此,家建设置可以用于这样的特定应用。
4.意义和未来的应用
LSFM可用迄今活胚胎大体积的快速成像的最佳方法。最上的共焦显微镜可以设想的实验也可以在与上述的优点的光片显微镜进行。在眼球发育中成像的情况下,LSFM的速度不是关键的参数。相反,低光毒性和灵活性样品定位是决定性的优点。
所述LSFM数据具有高的信噪比,这有助于实现良好的卷积结果和也是用于自动化图像分析和对象跟踪是有利的。总之,LSFM是在胚胎发育和overa产生可量化的数据一个伟大的工具LL细胞和用于随后模拟和有问题的过程的物理描述组织特性。
The authors have nothing to disclose.
We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].
Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
Low melting point agarose | Roth | 6351.1 | |
Low melting point agarose | Sigma | A4018 or A9414 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) | Sigma | E10521 | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
500 nm red fluorescent beads F-Y 050 | Millipore (Estapor) | 80380495 | |
20 μl (1mm inner diameter, marked black) capilllaries | Brand | 701904 | sold as spare part for transferpettor |
Teflon tip plungers for 20 μl capillaries | Brand | 701932 | sold as spare part for transferpettor |
Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm | Thermo scientific (Menzel-Glaser) | ||
O-rings for chamber windows 17×1.5 mm | Carl Zeiss Microscopy | ||
Tweezers, style 55 | Dumont | 0209-55-PO | |
50 ml Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 300865 | |
150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 397400 | |
Links | |||
Link 1 Multiview reconstruction application | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction | ||
Link 2 BigDataViewer | https://github.com/bigdataviewer | ||
Link 3 BigDataViewer | http://fiji.sc/BigDataViewer | ||
Link 4 Multiview reconstruction application-issues | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues | ||
Link 5 BigDataViewer-issues | https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues | ||
Link 6 BigDataServer | http://fiji.sc/BigDataServer. |