망막 색소 상피 (RPE) 대체 전략 및 유전자 기반 치료는 여러 망막 퇴행성 조건이 고려된다. 임상 번역, 큰 눈 동물 모델은 환자에 적용 할 수있는 수술 기법을 연구해야합니다. 여기에서 우리는 다양하고 비용 효율적인 RPE 이식에 맞 망막 수술 토끼 모델을 제시한다.
연령 관련 황반변 성 (AMD), 색소 성 망막염 및 기타 RPE 관련 질환은 산업 선진국에서 성인 비전의 돌이킬 수없는 손실에 대한 가장 일반적인 원인이다. RPE 이식은, 장애 RPE를 대체 그 기능을하여 시력을 복원 할 수 있으므로, 유망 치료로 나타납니다.
여기에서 우리는 토끼의 망막 하 공간 (SRS)에 지지체에 배양 된 망막 색소 상피 단층을 이식하는 방법을 설명합니다. 유리체 xenotransplants는 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)으로 코팅 된 플런저 20 게이지 금속 노즐 이루어진 주문품 사수하여 SRS로 전달 된 후. 현재의 기술 6 년 동안 150 개 이상의 토끼 수술의 진화. 수술 후 추적 관찰은 관류 고정 조직학 다음 스펙트럼 영역 빛 간섭 단층 촬영 (SD-10월)로 생체 내 이미징에서 비 침습적 및 반복 사용하여 얻을 수있다.
일전자의 방법은 쉽게 학습 및 높은 성공률에 대한 잘 정의 된 단계가 있습니다. 토끼는 임상 번역에 대한 전임상 연구에 유용 큰 눈 동물 모델 간주됩니다. 이러한 맥락에서 토끼는 다른 큰 눈 동물 모델에 비용 효율적이고 아마도 편리한 대안이다.
는 중심 시력의 상실을 초래로서 연령 관련 황반 변성 (AMD)은 공업 선진국에서 50 세 이상의 성인 시각 장애의 가장 흔한 원인이다. 이들 환자 중 약 15 %는 혈관 신생이 맥락막 및 망막으로부터 유래 한 기능을 방해하는 질병의 "젖은"형태 겪는다. 이 변이체는 항 혈관 형성 약물이 반복 인트라 vitreal 주사로 매우 효과적인 치료에 의해 치료 될 수있다. 그러나 환자 (~ 85 %)의 대부분은 망막 색소 상피 (RPE)하에 세포 외 침착 (예를 들어, 드루 젠)을 특징으로 건조 형태 겪는다. 이 예금은 황반 망막 위축으로 이어지는 망막 색소 상피 장애 원인이됩니다. 어떤 치료 치료 옵션의 부족을 감안할 때, AMD는 다양한 치료 치료 방법이 시험되고있다 집중적으로 개발하는 연구 분야로 진화. 외과 RPE 교체는하나의 매력적인 미래의 가능성이 쇠약 질병 (3)을 물리 칠 수 있습니다.
자가 망막 RPE 이식은 황반의 기능 장애 또는 손실 RPE를 대체, 그 생리 기능 4-9을 복원 할 수있는 가능성이있다. 이 수술 기법은 이식 10 과학자에게 RPE 무제한 셀 소스주는 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 및 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPSC)에서 RPE 분화 프로토콜의 개발로 돌파구를 가졌다. RPE 이식은 이제 줄기 세포 유래 치료제에 대한 매력적인 최초의 인간 응용 프로그램으로 인식되고있다. 눈은 생체 모니터링 도구 11-13 우수한 수술 접근하고 세련된을 제공합니다.
RPE 세포를 이식 한 방법은 최소 침습 전달 더 RPE 특성 및 이식 기능을 유지하기 위해, 대안 적으로, 인터넷 ARTI 인공 캐리어 SUBSTR를 세포 현탁액을 이용하여 인RPE 교체 ATES (발판)는 4,14,15으로 간주되고있다. 대형 동물 모델은 임상 검증, 아직 동물 처리 및 수술 기법이 최신 16-23로 누락에 대한 자세한 기술 정보가 필요합니다.
그 안전한 취급을 제공 단층 무결성 기능을 유지로 우리와 반대로 25 증거에도 불구하고 다른 11,24은 강성 아직 탄성 캐리어 기판의 사용을 제안한다. 시간이 지남에 따라 우리는 망막 하 공간 (SRS)에 전지 캐리어 지원 RPE 이식의 이식에 대한 몇 가지 맞춤 설계 악기 및 보조 기술을 테스트했습니다. 우리는 이식 성공 14,26,27을 평가하기 위해 스펙트럼 영역 빛 간섭 단층 촬영 (SLO / SD 간섭 단층), 및 조직학과 함께 생체 내 주사 레이저 검안경에, 수술 비디오 녹화를 이용했다. 여기에 우리가 토끼 망막 RPE 임플란트에 대한 현재의 권장 사항을 제공,이는 150 절차에 5 가지 토끼 균주, 7 세포 담체 물질과 4 RPE 세포 소스에서 테스트되었다.
토끼 모델을 사용하여, 안전하고 재생 가능한 방법은 맞춤 디자인 사수 악기와 망막 하 공간에 전지 캐리어에서 배양 RPE의 transvitreal 전달을 위해 제공됩니다. 이 망막 기동과 유리체 절제술에서 표준 기술을 수반으로하는 한 방법은, 쉽게 학습에 대한 짧은 / 최적화 된 수술 기법을 제공합니다. 결과는 크게 낮은 IOP에서 여과포 망막 박리 (BRD)를 유도 망막 및 건조를 통해 공막 손상, 그리고 토끼의 적절한 위치를 방지 주입 사이트를 통해 유체의 난류를 방지 깨끗한 유리체 망막 인터페이스 및 안내 주입에 의해 촉진된다.
우리는 예를 들어, 이식의 성공을 방해, 언제든지 발생할 수있는 여러 가지 수술 중 합병증으로, 그러나주의 내 안구 출혈, 마취, 이러한 주입과 같은 중요한 단계에서 떨어져 페이딩에 의한 기기의 조작 또는 눈 저 안압에 BRD의 붕괴, 아르 자형저산소 뇌 손상, 또는 고열을 일으키는 긴 운전 중 마취, 낮은 혈압의 과도한 복용으로 인해 abbit 죽음. 그들이 빨리 달려과 수술 팀의 경험을 증가시켜 해결되면 그러나 이러한 합병증은 시간에 따라 감소한다.
일부 합병증은 간단한 몇 가지, 아직 결정적인 단계에 따라 감소 될 수있다. 작업 중에 각막, 공막 및 결막의 손상을 방지하고 명확한 안내 미디어, 건조로 / 검게 공막이 차례로 눈 저 안압과 리드 상처 열개의 원인이 될 수있다 유지하기 위해 10 분 – 윤활유는 매 5를 추가해야 / 또는 sclerotomies에서 수술 누설. 헤파린은 특히 망막 이식 도전 동시에 에피네프린 헤파린 16하에 피 줄이기 위해 첨가한다 피브린 막의 형성을 방지하기 위해 첨가한다. 너무 오래 헤파린 / 에피네프린 노출 시간 (> 1 시간) 각막 루바을 방지하기 위해 피해야한다내피 부전 (33), 고혈압 성 위기 또는 수술 중 사망으로 엄마. 세심한 유리체 제거는 망막 및 / 또는 맥락막 박리를 방지하기 위해 악기 (항목) 포트에서 수행되어야한다. 인공 악기 렌즈 터치 (의원 성 백내장 형성의 원인) 또는 (항목 사이트) 망막 손상을 방지하기 위해 사후 극으로 지적되어야한다. 따라서이 제어되지 retinotomy 찢어 및 BRD의 붕괴를 방지 주입 주변 제트 기류를 감쇠으로하는 안구 측 포트 주입 뉼러가 사용되어야한다. BRD의 중간 선에서 유도 (시신경에서 수직 축) 또는 광학 medullar 섬유 가까이는 광범위한 의원 성 망막 박리를 방지하기 위해 피해야한다. 마지막으로, 마지막으로 적어도 BRD는 망막 손상으로 이어질 수 과도한 유량을 사용 (예., 스트레칭으로) 망막 BSS 주입을 방지하기 위해, 저 안압으로 유도해야하지.
이러한 세포 캐리와 같은 많은 연구 변수R 변형, 태아, 성인 또는 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포 소스, 면역 억제제에 대한 선택, 등., 14,26,27,34을 탐험 할 수 있습니다. 이러한 무 혈청 RPE 배양 방법, 망막 하 공간에 xenoRPE의 특성, 임플란트 고정에 대한 호스트 RPE 층 (14) 또는 전략의 제거와 같은 추가 개선이 진행중인 현재 작업입니다.
설명 된 기술 칠 놈, 친칠라 놈 / KBL 하이브리드, 뉴질랜드 화이트 / 레드 크로스, 뉴질랜드 화이트 (흰둥이)과 네덜란드 안전띠를 포함한 5 가지 토끼 균주에 사용 된 날짜합니다. 남성과 여성의 토끼를 모두, 수술 한 토끼와 함께 적어도 1.5 kg 또는 세 2 개월 (종에 따라 다름). 3kg – 대부분의 수술은 무게 2.5 사이에 착색 된 토끼 (칠 놈이나 칠 놈 하이브리드)에 있었다.
우리가 작업 할 수있는 기회를 가지고있는 토끼 균주는 모두 몇 가지 특수성을 갖고있는 것 같다. EXCLUS을 감안할 때2009-13 년 독일에서 칠 놈 균주의 색소 토끼의 필자 가용성, 우리는이 동물과 가장 경험을 수집했다. 불행하게도 그것은 번식이 중단 되었기 때문에, 더 이상 사용할 수 없습니다 만, 후자에 더 유리 두꺼운 공막과 큰 눈 볼륨을 제외하고 뉴질랜드 화이트 / 레드 크로스에 아주 잘 비교합니다. 친칠라 자식 하이브리드는 큰 수술 섬유소 형성이 성공적인 망막 기동을 보장하기 위해 위에서 설명한 바와 같이 헤파린 / 에피네프린의 사용을 필요로한다. 이 프로토콜은 또한, 비 착색 된 흰둥이 토끼 (뉴질랜드 화이트)에서 수행하지만, 특히 BRD 작성 및 망막 이식이 감소 대비 감사 주어진 더 도전하고있다. 후방 유리체 박리를 유발의 가능성은 우리의 손에 의존하는 토끼의 피로를 보이지 않았다.
Transvitreal 망막 배달은 가장 통신입니다 주어진 가능성이 선택의 미래 외과 전략 노선에 현재 임상 적으로 망막에 액세스 할 수 있습니다. 캐리어 동물 작업 11,15,23,35의 지원에 그 결과 많은 다른 그룹은 배양 된 RPE에 대한 이러한 기술을 발표했다. Aramant 등. (36)가 배치보다는 망막 대상 사이트에 자신의 하이드로 겔 캡슐 소프트 임플란트를 밀어 악기를 가지고 있습니다. Thumann 등의 디자인은. 유체 분사 (19)를 통해 전원을 부동하여 캐리어 지원 이식을 방출하는 중공 주걱을 사용합니다. 두 전 전략은 epiretinally appositioned 악기에 비해 우리의보기에, 합병증에 더 경향이 악기의 망막 삽입이 필요합니다. 몬테 등. (22)는 돼지의 망막 칩 이식의 전달을위한 망막 삽입 악기를 설명하지만 더 이상 작품은 우리가 아는 한에 있기 때문에 공개되지 않았다. 우리는 돼지에 약간의 수정과 함께 설명 된 기술을 확장 할 수 있었다.
jove_content "> 우리의 선호하는 휴대 캐리어가 10 미크론 두께의 폴리 에스테르 테레 프탈레이트 (PET) 멤브레인이다. 수술 관점에서 볼 때,이 물질은 세포 배양 실험 기간 동안 광범위한 다양성뿐만 아니라, 유리한 강성과 탄성 매개 변수가 있습니다. 우리는 확장 테트라 플루오로 에틸렌과 비슷한 경험을 발견 (37) 또는 나노 섬유 막을 PET, 폴리 락트산 / capronolactic 산 (PLCL) 또는 폴리 전기 방사 (의 ePTFE.) – 락트산 – 코 – 글리콜 산 (PLGA)뿐만 아니라, 복합 나노 파이버 (PLGA 또는 PET) 및 초박형 PET 26 때 PET 막은 우리의 금속 사수 기기와 함께 사용, 그들은 초슬림의 폴리이 미드 막이 우리 손에 위에서 설명한 프로토콜과 망막 하 공간에 이식 할 수 없습니다 (27). 사수에서 자신의 배출에 도전하는 정전기를 전시 가끔 경향이있다 할 ( 준비 원고).대리석 등. 체계적으로 자연 RESO을 공부의원 지역화 된 망막 박리 38-41에서 망막 유체의 rption. 심지어 망막 하 공간에서 조작 다음이이 사건 수술에서 수술 후 4 일째에 의해 재 흡수 될 밝혀졌다. 레이저 retinopexy는 retinotomy의 에지를 고정하기 위해 수행되지 않는다. 인간의 수술에 비해 직관적 때이지만, 공기 / 가스 주입술이 필요하지 않습니다. 주변 유리체의 세심한 제거는 달성 할 수없는 한, 특히 우수한 사분면에,이 사실에 retinotomy 사이트에서 발생하는 거대 망막 눈물의 원인이 될 수 있습니다. 단지 수술 의원 성 망막 박리 또는 특정 임플란트 위치를 확보 할 필요가 경우를 구제하기 위해 이후 20 % SF6 가스 주입술과 유체 공기 교환을 수행하는 것이 좋습니다.
신경 망막의 기계적 유도 절제 토끼 42, 43에서 RPE 및 광 수용체 손상을 일으킬 수 있지만, 그 정도는 크게 (심지어 일반 BSS)와 드 변화등과 연신함으로써 유도 망막 함께 사용 IOP, 주사기 형, 주입량 등의 요인에 보류. 우리는 또한 종종 권장 칼슘 / 마그네슘이없는 BSS가 분리 42-44을 용이하게 테스트하지만 (특히 높은 온도에) 수술 렌즈 혼탁이 발생, 크게 지연 또는 망막 재 부착 (27)을 손상 것으로 나타났습니다. (20)의 느린 망막 주입 – 100 μL 주사기와 일반 BSS의 30 μl의 볼륨 따라서 권장; 주사 바늘의 움직임은 주위 retinotomy 씰하므로 최소화 및 부르크 막 손상을 방지한다. 인성 손상 일부 RPE 상처 치유에 의해 해결하고, 재 부착 후 ONL 두께 관찰 상대적 보존 또한 다른 45 바와 같이 RPE / 감광체 착물이 손상을 견딜 수있는 것을 제안한다.
세포 기반 치료제 또는 망막 보철은 전임상 애니 마이 필요리터 테스트 이전에 규제 당국의 승인과 인간의 안전 연구를 시작. 전자는 국가별로 다를 수 있습니다. 여기에 설명 된 토끼 모델 확립 또는 규제 당국의 모든 요구 사항을 수행하기위한 비용 효율적이고 덜 까다로운 플랫폼으로서 기능 할 수있다. 또한, 이후 최종 다기관 임상 시험 또는 길을 따라 기술의 추가 개선에서 외과 의사의 훈련을 위해 역할을 할 수있다.
The authors have nothing to disclose.
2008 년 & 2010 년 (BVS), BONFOR / Gerok 장학금 O-137.0015 (BVS), BONFOR / Gerok 장학금 O-137.0019 (FT), 독일 연구 협회 / DFG (BVS) STA 1135 / 2-1, 중국어 뤼디거 재단 보조금에서 지원 장학위원회 제 2008627116 (ZL)와 Geuder AG, 하이델베르크 (그림. 2)에 의해 제한 부여. H. Skottman의 실험실의 구성원은, 탐 페레 핀란드의 대학은 감사도 2에 도시 된 RPE를 유도 배아 줄기을 제공하기 위해 인정된다.
s30 ultrasonic cleaning unit | Elmasonic | 100 4631 | 2.75L |
DE-23 autoclave | Systec | C 2209 | 23L |
Syringe | BD | 300013 300995 301285 300294 300330 |
1ml x3 2ml x3 5ml x1 10ml x1 20ml x1 |
Needle | BD | 305196 305136 |
18G x 1 27G x5 |
Scalpel | Feather | 2975#20 | blade#20 x3 |
Surgical drape | HARTMANN LOHMANN & RAUSCHER |
277 502 25 440 |
60×40 cm x2 12×17 cm |
Ocular sticks | LOHMANN & RAUSCHER | 16 516 | 66×5 mm |
Twister gauze sponges | HARTMANN | 481 274 | x2 |
Closure strips | HARTMANN | 540 686 | x4 |
Opmi Visu CS Microscope | Zeiss | N/a | incl. fundus imaging system BIOM II |
Chandelier endoillumination | Geuder | G-S03503 + G-S03504 |
25G incl. trocar |
Light machine | Geuder | G-26033 | Xenotron III |
Vitrectomy machine | Geuder | G-60000 | MegaTRON S4 S4/ HPS |
Vitrector | Geuder | G-46301 | MACH2 vitreous cutter 23G |
Venturi cassette | Geuder | G-60700 | |
Sideport-infusion cannula | Geuder | custom | 1x23G |
3-0 silk suture | ETHICON | V546G | x1 |
Caliper | Geuder | G-19135 | x2 |
Vannas scissors | Geuder | G-19777 | x1 |
Sclerotomie blade | Ziemer | 21-2301 | 1x23G 1x20G |
7-0 silk suture | ETHICON | EH6162H | x1 |
Needle holder | Geuder | G-32320 | x2 |
Iris forceps | Geuder | G-18910 | x1 |
Colibri forceps | Geuder | G-18950 | x1 |
Extendible subretinal injection needle | DORC | 1270.EXT | 41G |
VR scissor | Geuder | G-36542 | 25G |
Grieshaber forceps holder | Alcon | 712.00.41 | 23G |
Curved scissor forceps tips | Alcon | 723.52 | 23G |
Implant loading station | Dow Corning | 3097358-1004 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
blunt oval implant trephine | Geuder | custom-made | 2.4 x 1.1 mm |
Shooter dummy | Geuder | G-32227 | x1 |
Shooter | Geuder | G-S03443 | x1 |
Flute needle | DORC | 1281.SD | 20G (Vacuum) |
Manual microliter syringe | Hamilton | 24535 | 100µl |
Tissue culture plates | Greiner bio-one | 664160 | 100 x 20 mm |
Spectralis Multi-Modality Imaging System |
Heidelberg Mühendislik |
N/a | Spectralis HRA + OCT |
Drugs and solutions | |||
Name | Company | Active agent | Yorumlar |
Mucadont-IS | Merz Hygiene | virucidal instrument disinfectant | 2L |
Mucocit T | Merz Hygiene | Aldehyde-free instrument disinfectant | 2L |
Ketamin 10% | WDT | Ketamine | 10ml (100mg/ml) |
Domitor | Orion Pharma | Medetomidine hydrochloride | 10ml (1mg/ml) |
Antisedan | Orion Pharma | Atipamezole hydrochloride | 10ml (5mg/ml) |
Neosynephrin POS 10% | URSAPHARM | Phenylephrine HCl | 10ml |
Mydriacyl | Alcon | Tropicamid | 10ml (5mg/ml) |
Methocel 2% | Omni Vision | hydroxypropyl methylcellulose | 10g |
PURI CLEAR | ZEISS | Balance salt solution (BSS) | 500ml |
Glucose 5% | B.Braun | Glucose 5% solution | 100ml |
Heparin-Natrium-25 000 | Ratiopharm | Heparin | 5ml (2500 unit/ml) |
Suprarenin | SANOFI | Epinephrine | 1ml (1mg/ml) |
Triamcinolone | University of Bonn pharmacy | preservative-free Triamcinolone | 1ml (40mg/ml) |
Isoptomax eye ointment | Alcon | dexamethasone 1 mg/g neomycin sulfate 3,500 IU/g polymyxin B sulfate 6,000 IU/g |
10ml |
Betaisodona | Mundipharma | Povidon-Iod | 30ml (1g/10ml) |
Optive | ALLERGAN | sodium carboxymethylcellulose glycerol | 10ml |