מנגנון הוויסות של מספרי adipocyte למבוגרים אורגניזמים באמצעות בידול הומאוסטזיס אפופטוזיס
Özet
Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.
Abstract
Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of adipocytes, which in turn induces abnormal secretion of adipokines, triggering metabolic syndromes such as obesity, dyslipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, insulin resistance and type 2 diabetes. Therefore, investigating the molecular mechanisms behind adipocyte dysregulation could help to develop novel therapeutic strategies. Our protocol describes methods for evaluating the molecular mechanism affected by hypoxic conditions of the AT, which correlates with adipocyte apoptosis in adult mice. This protocol describes how to analyze AT in vivo through gene expression profiling as well as histological analysis of adipocyte differentiation, proliferation and apoptosis during hypoxia exposure, ascertained through staining of hypoxic cells or HIF-1α protein. Furthermore, in vitro analysis of adipocyte differentiation and its responses to various stimuli completes the characterization of the molecular pathways behind possible adipocyte dysfunction leading to metabolic syndromes.
Introduction
על פי הדיווח 2014 של ארגון הבריאות העולמי, 39% מהאוכלוסייה הבוגרת בעולם סובלים מעודף משקל, ו -13% הם 1 שמנים. בעתיד הקרוב, אנשים הסובלים מעודף משקל יהוו חלק משמעותי של אוכלוסיית הקשישים. תכונה חשובה של השמנה והזדקנות היא חוסר ויסות של שומן ביחס לתחלואה ותמותה 2. Adipokines, חלבונים המופרשים על ידי רקמת השומן (AT), יכול לעורר התסמונת המטבולית כמו השמנה וסוכרת מסוג 2 3. מחלות מטבוליות נגרמות בעיקר על ידי אחסון אנרגיה מופרז טיפות השומנים של adipocytes, שתוצאתה AT הרחבה 4. לכן עניין לקבוע את הסיבות ואת המנגנונים המולקולריים של רחבת AT כדי למצוא הזדמנויות לשלוט בו.
יתר התזונה מוביל התרחבות AT, אשר מווסתת על ידי שני אירועים: אחסון אנרגיה מוגזם לתוך טיפות השומנים של adipocytes, תהליךמוביל היפרטרופיה (גידול בגודל adipocyte), ו adipogenesis גדל, הידוע גם בשם adipocyte היפרפלזיה 5. Adipogenesis הוא תהליך של התמיינות של תאי גזע mesenchymal מולטיפוטנטיים (MSC) לתוך adipocytes. ראשית, MSCs להתפתח preadipocytes בשלב המחויב. שנית, preadipocytes נוספת להבדיל לרכוש את התכונות של adipocytes בוגרת ופונקציונלי 6. כמה גורמי שעתוק זוהו רגולטורים לקביעת preadipocyte, כגון חלבון אצבע אבץ 423 (Zfp423) גורם תא מוקדם B 1 (Ebf1). בעוד Zfp423 גורם התחייבות מוקדמת, Ebf1 נדרש עבור הדור של אבות adipocyte 6. בידול מסוף נתונה לפיקוח הדוק על ידי מפל תעתיק, לפיה γ קולטן peroxisome המופעל proliferator (PPARγ) הוא הגורם 7 תעתיק חיוני. גורמי תעתיק מפתח נוספים הם חלבון CCAAT / מחייב המשפר (C/ EBP בני משפחה) (כלומר, C / EBPα, C / EBPβ, ו- C / EBPδ), גורמים דמויי kruppel (KLFs), חלבון מחייב אלמנט תגובה cAMP (CREB) ותגובה הצמיחה המוקדמים 20 (Krox20) 6.
לאחרונה, הוכיח כי מפעיל חלבון-1 (AP-1) המשפחה מעורבת 8,9 תהליך התמיינות adipocyte. מש' AP-1 נוצרה על ידי קומפלקס חלבון dimeric, מורכב Fos, יוני ו / או גורם שעתוק הפעלה (ATF) חברים. Fos הקשורות אנטיגן 1 ו -2 (FRA-1 והאח-2) מסוגלים לווסת בידול adipocyte. פרה-1 פוגעת בידול adipocyte ידי עיכוב C / EBPα 8, ואילו adipocyte שולטת פרא-2 מחזור 9. פרה-2 ובכך לא רק מקטין את מספר adipocyte ידי דיכוי הביטוי PPARγ2 במהלך התמיינות adipocyte, אלא גם מקטין אפופטוזיס adipocyte באמצעות דיכוי ישיר של גורמים מושרה היפוקסיה (HIFs) הביטוי. משפחת HIF הוא heteמורכבות גורם שעתוק rodimeric, מורכבת-1α HIF, HIF-2α ו-1β HIF. Heterodimers מורכבת למקטע HIF-1β חמצן רגיש HIF-α חלבון (HIF-1α או HIF-2α) ואת רגישות-חמצן 10. במהלך normoxia, חלבונים-α HIF הם פולי-ubiquitinylated והם מושפלים לבסוף על ידי פרוטאזומים 11. בתנאי חוסר חמצן, המתרחשים AT במהלך התרחבות, חלבונים-α HIF כבר לא hydroxylated. לכן הם הופכים הדימרים התייצב טופס עם HIF-1β הביע constitutively. הפעלת תעתיק של גנים בשליטת האלמנטים בתגובת HIF היא מעורבת בוויסות של אנגיוגנזה, מטבוליזם, ודלקת 12. ואכן, HIF-1α מקדם AT תפקוד ידי גרימת סבילות לגלוקוז, עיכוב הוצאה אנרגטית ושימוש היקפי של שומנים בדם, כמו גם על ידי הגדלת הרמה לפטין HFD-induced 13 steatosis בכבד. יתר על כן, HIF-1α מסדיר adipocyte אפופטוזיס in vivo ו במבחנה 9.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות ללימוד AT המעמד לפענח את המאפיינים המולקולריים של הומאוסטזיס adipocyte בעכברים בוגרים. זה מראה עד כמה אפופטוזיס, שגשוג והתמיינות של adipocytes in vivo ו in vitro יכול להיות מוסדר על ידי היפוקסיה. לשם כך, אנו משתמשים בעכברים עם מחיקת adipocyte הספציפית של פרה-2 שנוצרה על ידי חציית עכברים שנשאו את אללים floxed פרא-2 עם Fabp4-CreERT עכברי 9. באמצעות Fabp4-Cre עכברי ERT, המחיקה היא adipocyte ספציפית מושרה בזריקת טמוקסיפן 14. עבור הדגם המבוגר, זריקות הצפק תוך של טמוקסיפן מבוצעות מעל 5 ימים רצופים החל בגיל 6 שבועות. כך, העכברים חשופים דיאטה רגילה או דיאטה עתירת שומן במשך 6 שבועות לפני הניתוח מתבצע. העכברים השתמשו במחקר זה זכר התבססו על רקע C57BL6 להימנע הורמונים נשיים, כגון אסטרוגניםלעין, כדי להסדיר את חלוקת השומן בגוף 15. שימוש אחר רקע גנטי עשויה גם לשנות את הפנוטיפ ומטבוליזם, בגלל הבדלים הקשורים למתח שומנים וניהול 16.
פרוטוקול זה מדגים כיצד לנתח AT תחת היפוקסיה באמצעות היסטולוגיה וכיצד לכמת אפופטוזיס adipocyte, התפשטות והבחנה in vivo באמצעות פרופיל אימונוהיסטוכימיה וגן מנתח. המחקר הושלם על ידי ניסויים במבחנה, מראים כיצד לנתח בידול adipocyte ראשוני אפופטוזיס לשנות על ידי חשיפה היפוקסיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipocytes מאופיין phenotypically על ידי גודלם, מספרים באזור, חושף היפרפלזיה adipocyte ו היפרטרופיה, הנגרמת על ידי אחסון אנרגיה מוגזם בשל יתר התזונה 5. אירועים אלה המוביל dysregulation חומצות שומן ו תסמונת המטבולית לאחר מכן הם גם קובעים של מסת שומן גדלה עם חילוף חומרים משומרים, אשר גם הוא המכונה רחב שומן "בריא". לדוגמה, Kusminski et al. 21 הראו שעכברים עם התרחבות שומן מאסיבית להישאר בריאים מבחינה מטבולית, דבר המצביע על כך הרחבה שומן אינו קשור בהכרח התסמונת המטבולית ועליו להיות נחוש בקפידה כדי להעריך את המאפיינים של adipocytes. הרקמה השומנית (AT) ממלא תפקיד מרכזי בוויסות חילוף החומרים בגוף. AT הוא האיבר הגדול ביותר האנדוקרינית שיכול להשפיע דיסליפידמיה, טרשת עורקים, היפראינסולינמיה והיפרגליקמיה 3. הערכת AT הומאוסטזיס ואת מ המולקולריתechanisms ויסות זה יכול לאפשר הבנה טובה יותר של הפרעות במערכת חילוף חומרים. לכן, לפרום את מנגנוני ויסות בידול adipocyte, גודל adipocyte ומסת כרית שומן יעזרו לפתח טיפול טיפולי חדש לטיפול בהפרעות להשמנה. שימוש videodan vivo ו שיטות במבחנה, אפשר לקבוע את התפקיד של השפעות מזון ביטוי גנים על בידול adipocyte ופעילות. כדי לקבוע את הומאוסטזיס AT, קביעת האיזון בין דיפרנציאציה adipocyte, התפשטות אפופטוזיס כפי שהוצע על ידי פרוטוקול שלנו חשובה כמו בניתוח מטבולית גלוקוז ואינסולין בתגובה 22-24.
פרופיל ביטוי המנתח של גני המעורבים adipogenesis, lipogenesis, ליפוליזה, ספיגת חומצות שומן, היפוקסיה, אפופטוזיס ובחלוקה ב adipocytes העיקרי ו- AT הקרבי הוא שיטת תפוקה גבוהה לקבלת סקירה על הומאוסטזיס adipocyte וחוסר התפקוד האפשרי שלהם.יש לנתח מועמדים מעניינים נוספים ברמת החלבון על ידי כתם המערבי או מכתים immunohistological. כדי להשיג תוצאות אופטימליות באמצעות מערכת בזמן האמת PCR באמצעות צבעים לא-סימטרית cyanine, הריכוזים של cDNA בטווח שבין 1 ל 10 ng ועל ריכוזי פריימר האופטימליים הנעים בין 50 ל 900 ננומטר צריכים להיבדק כדי למזער הגברה ספציפית. הרכיבים הקריטיים הם פריימרים; עבור כל מחזור, עקומות ההיתוך צריך להיות מבוקרת בקפידה כדי להבטיח את הספציפיות, ובו בזמן למנוע היווצרות של הדימרים פריימר. לכן, באמצעות בקרה שלילית באות O H 2 במקום cDNA מומלץ. יתר על כן, צבעי cyanine לא-סימטרית מסחריים זמינים ניתנים תערובות מאסטר המכילים צבע הפניה פסיבי (כגון רוקס) לספק אות ייחוס פנימית. את cDNA האות מנורמל במהלך ניתוח הנתונים לאותות רוקס לתקן תנודות האות גם ל-כן. נקודה נוספת שיש לקחת בחשבון על מנת להקים gooמערכת ד qPCR היא הבחירה של גן המשק. עבור כל תנאי, גני משק כמה משמשים, למשל, HPRT, β-תקטין, GAPDH, β-2-MG או Hsp90.
חלבוני HIF על מנת לייצב את תנאי חוסר חמצן הם רגולטורים בקביעה לא רק הישרדות adipocytes, אלא גם שינויים מטבוליים, כגון גלוקוז, סבילות לאינסולין ומטבוליזם שומנים 11,25,26. כדי לברר אזורים היפוקסי של כרית השומן, HIF-1α נקבע בקטעים ידי אימונוהיסטוכימיה. מאז חלבוני HIF מפורקים במהירות בתוך 5 עד 10 דקות בתנאי normoxic, ההליך ואת הקיבעון של כרית השומן לניתוח היסטולוגית יש פיקוח הדוק כדי למנוע זמן חביון. לכן, כדי להבטיח היפוקסיה לא רק באמצעות מכתים HIF, pimonidazole משמש לקביעת אזורים היפוקסי של AT. Pimonidazole הוא מסוגל להפיץ לרקמות, כפי שהוא כבר הוצג בעצמות 27, וביעילות לסמן אזורים היפוקסי באמצעות קשירה המכיל חלבונים תיאול ספציפי בתאי חוסר חמצן, אשר מזוהים יותר בסעיפים היסטולוגית על ידי נוגדנים ספציפיים מחייבים 28. עם זאת, סמנים ושיטות אחרים ניתן להשתמש כדי לנתח את מסלול היפוקסיה. לדוגמה, מעורבות של hydroxylase prolyl (PHD) אנזים, אשר לגרום hydroxylation של שאריות פרולין תחת normoxia, כמו גם את פון היפל-לינדאו (VHL) חלבון, אשר מכירים prolines hydroxylated וגם להביא את-ubiquitination פולי לתווך HIF proteasomal שפלה, צריכה להיות מנותחת עבור סקירה מלאה של 29,30 המסלול. יתר על כן, איתור בכל מקום של HIFs היה גם לקבוע את יציבות החלבון והשפלה שניתן לשנות 31,32.
יתר על כן, התפשטות ידי Ki67 ו אפופטוזיס על ידי מכתים TUNEL נקבעים in vivo באמצעות מכתים סעיפים היסטולוגית AT. כימות של התפשטות ידי Ki67 וpoptosis ידי TUNEL או Annexin מכתים V באמצעות ניתוח תזרים cytometry מתבצעת גם 33. הפצת נשק יכול כמובן להיות נמדדת טכניקות אחרות כגון ניתוחים של מחזור התא adipocyte, אשר אינה מקבלת מענה מדידת תאים חיוביים Ki67. יתר על כן, מחקר אפופטוזיס על ידי TUNEL ניתן להשלים על ידי FACS המנתח של V Annexin ו TOP-PR-3 אשר יקבע את הרמות של נימק מול תהליך המוות של תאי אפופטוזיס. אפופטוזיס הוא תהליך בסיסי עבור התוכנית של מוות של תאים, שהינה חשובה הומאוסטזיס AT. אכן, חוסר וויסות של אפופטוזיס adipocyte היה מעורב בעבר בתהליכי תורם להשמנה lipodystrophy 34. יתר על כן, בשנת 2011, ואח Keuper. צמוד דלקת רקמת שומן לאפופטוזיס adipocyte. הם הראו כי מקרופאגים לאפופטוזיס ב preadipocytes ו adipocytes, אשר בתורו למשוך מקרופאגים. הגיוס של מקרופאגים מאיץ דלקת, אשר contributes כדי התסמונת המטבולית כגון סבילות לגלוקוז ואינסולין 35. עם זאת, אפופטוזיס adipocyte הוא עדיין תופעה גרועה למדה, למרות ההשערה לאפופטוזיס adipocyte יכול להביא לפגיעה במשקל.
הפרוטוקול הנוכחי משתמש גישות immunohistochemical לחקור תופעה שונה כגון התפשטות, אפופטוזיס היפוקסיה in vivo. לכן, הרקמה הייתה קבועה עם 4% פורמלדהיד, אשר הוא שלב קריטי. זמן קיבעון רקמות מורחב מוביל לשנות של אפיטופים, אשר הופכים בלתי נגיש עבור הנוגדן. לעומת זאת, זמן קצר קיבעון מגביר את הרגישות של אפיטופים כדי ריאגנטים. הזמן האופטימלי המומלץ של קיבעון הוא 24 שעות. יתר על כן, העובי של החלקים גם משפיע על הנוגדנים מחייבים אפיטופים שלהם; עובי אופטימלי הוא בין 2 ל 5 מיקרומטר. סעיפים עבים מ -5 מיקרומטר ינתנו תוצאות חיוביות כוזבות בשל אתרי קישור גדלו. לעומת זאת, זהections יותר רזה 2 מיקרומטר מכילים פחות אתרי קישור ושטחים חיוביים אינם מוגדרים היטב. גורמים קריטיים נוסף הם הנוגדן עצמו, זמן דגירה, הריכוז ואפילו הטמפרטורה, אשר משפיע על האיכות הספציפית מחייב את אפיטופים. לכן, אימות שעת ריכוז דגירת נוגדן היא הכרחית עבור כל תנאי.
כדי להשלים את המחקר, אנו מספקים פרוטוקול בידול במבחנה adipocyte, אשר יכול להיות מורחבת על ידי טיפולים שונים, גירוי או שיתוף תרבויות. באמצעות בתרבויות adipocyte במבחנה, זה אינו ריאלי לקבוע פגמים בידול adipocyte ופונקציות. להשגת תוצאות מהימנות, כמו עבור כל התאים הראשוניים, את ההתנהגות והמראה הבריא של ADSCs ו adipocytes חשובה למדי. הגרעיניות, vacuolations cytoplasmic ו / או ניתוק הם סימנים של הידרדרות, המציין בינוני לקוי, זיהום מיקרוביאלי או הזדקנות של בפריימריזתאים. פרוטוקול זה משתמש adipocytes מבודד מן רקמת כרית שומן, בעוד הוא גם ניתן להשתמש בתאי גזע mesenchymal המבודדים מח עצם כפי שתואר על ידי פרוטוקולים אחרים 36. האחרון כולל ובתאי סטרומה, אשר עשוי לשקף בעיות בידול נוספות המתרחשות הצעד מאוד מוקדם של בידול adipocyte, זה עלול לפספס בפרוטוקול הנוכחי שלנו. יתר על כן, ADSCs ניתן להרחיב במהירות (יותר מ -10 פעמים בתוך שבוע אחד), ו ADSCs בתרבית לטווח ארוך לאחר בקטעים מסוימים עדיין שומרים mesenchymal שלהם pluripotency 37,38. יתרון נוסף באמצעות ADSCs הוא שאפשר לעבור אדם בקלות, מאז ADSCs ניתן לקצור מחולים ידי שאיבת שומן שהיא שיטה פשוטה פולשנית.
ליום משפיע כמה איברים אחרים בצורה האנדוקרינית, הפרוטוקול צריך להיות מורחב adipokines. Adipokines, כגון לפטין, אדיפונקטין, נמק הגידול-α גורם (TNF) אnd resistin, מופרש על ידי adipocytes ידועים בהשפעתם מחלות מטבוליות ידי שליטה חילוף החומרים של השומן, הומאוסטזיס אנרגיה אינסולין רגישות 39. לכן, סרום וניתוחי adipocyte secretome צריכות להתבצע. במקרה של חוסר תפקוד AT, adipokines וציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון IL-6, יכול להוביל חוסר ויסות של איברים כמו הכבד והלבלב, ושל שריר פונקציה 4. על מנת לשלול בעיות בתפקוד איבר מערכתיים, במודלים של בעלי חיים או תרביות תאים יכולים להיבדק לתגובתם לגלוקוז גירוי ספיג.
כאן אנו מספקים פרוטוקול לניתוח המדינה היסוד של AT ו adipocytes in vivo ו במבחנה כדי לחשוף את המנגנונים המולקולריים של הומאוסטזיס adipocyte ופונקציונליות.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים בחביבות להודות לד"ר י'לותר ק Ubieta להכנת הנתונים וד"ר ב Grötsch להגהה את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-אמי נתר).
Materials
| RNAlater solution | Ambion | AM7021 | RNA stabilization solution |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| SYBR Select Master Mix | 4472908 | ||
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 | BD Biosciences | 550609 | Clone B56 (RUO) |
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO) | 550609 | Proliferation marker | |
| FITC Annexin V | BioLegend | 640906 | |
| Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb | Cell signalling | 9664S | Clone 5A1E |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | 9664 | Apoptosis marker | |
| Hypoxyprobe-1 Plus Kit | Hypoxyprobe | HP2-200Kit | Hypoxia marker, Solid pimonidazole HCl (Hypoxyprobe-1), FITC conjugated to mouse IgG₁ monoclonal antibody (FITC-MAb1), Rabbit anti-FITC conjugated with horseradish peroxidase |
| Lipofectamine2000 Reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| TO-PRO-3 Iodide | T3605 | Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation⁄Emission: 642⁄661 nm | |
| Mayer’s hemalum | Merck | 109249 | hematoxylin |
| pegGOLD TriFast | Peqlab | 30-2030 | TRIzol, single-phase solution of guanidinisothiocyanat and phenol |
| Percellys Ceramic Kit 1.4 mm | 91-PCS-CK14 | tubes containing ceramic beads (1.4 mm) | |
| Precellys 24 | 91-PCS24 | homogenizer | |
| HIF-1 alpha Antibody | Pierce | PA1-16601 | |
| HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13 | 700505 | Hypoxia marker | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Roche | 11 684 795 001 | TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) |
| Eosin | Sigma | 318906 | |
| DNase I Solution (1 unit/µL) | Thermo Scientific | EN0525 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | Vector Laboratories | BA-9200 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | BA-1000 | ||
| Vectastain ABC Kit | PK-4000 | ||
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | H-1200 |
Referanslar
- Gong, Z., Muzumdar, R. H. Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging. Int J Endocrinol. , 320482 (2012).
- Deng, Y., Scherer, P. E. Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).
- Rezaee, F., Dashty, M. Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases. J Diabetes Metab. , 008 (2013).
- Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. The cell biology of fat expansion. J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).
- Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1 (2015).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metab. 4, 263-273 (2006).
- Luther, J., et al. Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy. J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).
- Luther, J., et al. Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia. Cell Death Differ. , (2014).
- Semenza, G. L. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).
- Kim, W., Kaelin, W. G. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer. Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).
- Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. Oxygen sensors at the crossroad of metabolism. Cell Metab. 9, 11-22 (2009).
- Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction. Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).
- Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).
- Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin. Diabetes. 55, 978-987 (2006).
- Haluzik, M., et al. Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Planat-Benard, V., et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 109, 656-663 (2004).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).
- Trajcevski, K. E., et al. Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model. PLoS One. 8, 71747 (2013).
- Montgomery, M. K., et al. Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding. Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).
- de Queiroz, K. B., et al. Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet. Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).
- Ye, J. Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance. Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).
- Xiong, Y., et al. The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue. Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).
- Bozec, A., et al. Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia. Nature. 454, 221-225 (2008).
- Varia, M. A., et al. Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma. Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).
- Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability. Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).
- Tennant, D. A., et al. Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death. Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).
- Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool. Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).
- Amelio, I., et al. TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).
- Suga, H., et al. Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells. Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. J Diabetes Res. 2015, 970375 (2015).
- Keuper, M., et al. An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).
- Sera, Y., et al. Hematopoietic stem cell origin of adipocytes. Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Doku mühendisliği. 7, 211-228 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Scherer, P. E. Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ. Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).
