디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

윤리 정책 : 모든 프로토콜은 다트머스 기관 바이오 안전성 및 기관 동물 관리 및 사용위원회 검토 보드에 의해 승인되었다. CRISPR / Cas9 레트로 바이러스에 대한 가이드 스트랜드 (sgRNA)를 설계 1. 프로토콜 참고 : (https://benchling.com/ 및 http://crispr.mit.edu/) 관심의 유전자를 대상으로 s​​gRNAs를 생성하는 데 사용할 수있는 많은 비영리 웹 사이트가있다. 이 프로토콜의 설계 목표는 서로 어닐링 상업적 공급 업체로부터 단일 가닥 올리고를 주문하는 것이다. 이 어닐링은 올리고 PXL 전송 벡터에 라이 게이션 될 것이다. Benchling를 사용하여 설계 sgRNAs의 예를 들어 보충 비디오 1을 참조하십시오. sgRNAs를 설계 전용 웹 사이트를 사용합니다. 참고 : 예를 들어, 웹 사이트에 관심있는 유전자의 시작 근처에서 부호화 / 엑손 서열을 입력하면 20 뉴클레오티드 sgRNA를 생성한다. 센스 및 안티센스 올리고 설계를 20 sgRNA 뉴클레오티드 서열을 사용하여sgRNA를 만들 것을 명령한다의. sgRNA를 생성 한 후, 워드 프로세서로이 순서를 복사합니다. 이미 한 (즉, G-20 염기 sgRNA 순서)로 시작하지 않을 경우 문서의 20 염기 sgRNA 시퀀스의 시작 부분에 G (구아닌)를 추가합니다. 이것은 U6 프로모터 오프 우수한 전사를 보장 할 필요가있다. 이 지금은 20 ~ 21 염기 서열의 역 보완을 문서화. 센스 올리고 들어, 문서 (즉, CACC-G-20 염기 sgRNA 순서)의 순서의 5 '말단에 "CACC"를 추가합니다. 이 돌출부는 PXL 벡터에 서열을 결찰하는데 사용된다. 안티센스 올리고 들어, 5 '말단에 AAAC를 추가합니다. PXL 벡터에 순서를 결찰이 오버행을 사용합니다. 센스 및 안티센스 올리고를 얻습니다. 올리고를 수신 한 후, DNase를 무료로 물을 사용하여 100 μm의 주식을합니다. 4 μ와 함께 10 ㎕를 100 μM 센스 및 안티센스 올리고 각 믹스배 NEB 버퍼 2, 물 16 μL의 L. 참고 :합니다 (발현 벡터는 BbsI의 오버행이 호환되지 않는 응집력 끝이기 때문에) 그들은 페이지 정화 또는 5'phosphorylation 필요하지 않습니다. 다음 발포체 "부유물"홀더의 혼합물을 포함하는 튜브를 플로트, 500㎖의 비이커에 종기에 200 ml의 물을 준비한다. 실온에서 2 시간 동안 95 ° C에서 천천히 시원한 물을 수 있습니다. 멸균 수에 1000을 다음 내고 즉시 사용 또는 -20 ° C에서 나머지 반응을 저장 : 지금 어닐링-올리고 믹스 1을 희석. 다이제스트 PXL, 2 시간 동안 37 ° C에서 발현 벡터는 BbsI 제한 효소와 벡터 PX330 유도체. PXL의 2 μg의, Bbs1와 균형의 물을 10 배 NEB 버퍼 2, 1 μL의 4 μl를 포함하는 40 ㎕의 반응을 사용합니다. 상용 키트를 사용하여 일상 젤 정화에 소화-PXL 대상으로 할 수 없다. 수율은 8.5 킬로바이트 제품이 ~ 있는지 확인합니다. 1000 : 상용 라이 게이션 키트를 사용하여, (1) 1 μl를 결찰소화 겔 정제-PXL의 50 NG와 어닐링-올리고. E. 능력 결핍 재조합로 결찰 생성물을 변환 대장균 (NEB 5-α, 서브 클로닝 효율). 플라스미드 DNA 시퀀싱하여 정확한 가이드의 존재에 대한 형질 전환 체를 선별. BstB1 및 PAC1 제한 효소를 사용 PXL 밖으로 U6, 가이드 가닥 및 RNA 지지체 요소 (sgRNA)를 소화하고 동일한 제한 효소로 분해 형광 단백질-T2A Cas9 바이러스 골격 내로 결찰. 결찰 생성물 (NEB 5- 알파 최대 효율) 변화. 형광 단백질-T2A Cas9 바이러스 골격 플라스미드 적은 카피 플라스미드이며, 따라서 적은 카피 프로토콜이 사용되어야한다. 참고 : 두 번째 sgRNA 마찬가지로 다른 PXL 가이드 가닥 플라스미드의 PACI 소화에 의해 도입과 PAC1로 결찰 할 수는 소화와 송아지 장 포스는 이미 제 1 가이드 가닥을 포함하는 바이러스 백본을 처리 하였다. 바이러스 전송 플라스미드의 포스 파타 아제 치료는 도움이 될 것입니다상기 제 2 가이드를 포함하지 않는 플라스미드자가 결찰에서 형질 전환 체의 수를 감소시킨다. 순서는 Nucleobond 엑스트라 맥시 준비 키트를 사용하여 최종 플라스미드와 맥시 준비를 확인하고 다음 "레트로 / 렌티 바이러스 생산을위한 프로토콜 – CaPO4 방법"을 사용하여 바이러스로 패키지. 2. 형질에 대한 293FT / 293GP 세포를 준비 (레트로 / 렌티 바이러스 생산 – CaPO4 방법) (주 1) 신속하게 37 ° C의 물을 욕조에 10cm 세포 배양 접시 당 세포의 1 병을 해동. 렌티 바이러스 포장, 293FT 세포를 사용합니다. 레트로 바이러스 포장, 293GP (개그 / POL) 세포를 사용합니다. 15 ML 원뿔 관에 크라이 관에서 해동 세포의 모든 피펫과 미리 예열 CO 2 평형을 완성 Iscove의 수정 된 둘 베코의 중간 2 ㎖ 추가 할 수 있습니다. 500 XG에 5 분 동안 원심 분리기 세포 펠릿합니다. 뜨는을 대기음하고 완전한인가 10ml에 세포 펠렛을 재현 탁코브의는 둘 베코의 중간을 수정. 10cm의 세포 배양 접시에 세포를 접시. 5 % 이산화탄소 배양기에서 37 ℃에서 하룻밤 동안 세포를 인큐베이션. (주 2) 도금 후 24 시간은, 기존의 미디어를 흡입하고 판에 미리 예열 Iscove의 수정 된 둘 베코의 중간 10 ㎖를 추가하여 접시에 미디어를 변경합니다. 24 ~ 48 시간 미디어 변경 후 및 세포 번 (하루 3-4) 합류가 / 판 (10cm 플레이트) 2.5-3.0 × 10 6 세포의 포화 상태로 세포를 분리. 셀을 분할하려면 미디어를 기음과 PBS 5 ㎖로 접시를 씻으십시오. 접시에 0.25 % 트립신 1 ML을 추가하고 세포가 판을 들어 올릴 때까지 37 ° C에서 품어. 0.25 % 트립신 반응을 중화하고 1.5 ML 튜브에 세포를 피펫에 Iscove의 수정 된 둘 베코의 중간의 0.5 ML을 추가합니다. 5 분 동안 500 XG에서 세포를 스핀. Iscove 개변 둘 베코 배지 1 ㎖로 세포를 재현 탁. (10)를 희석(81), PBS의 90 μL 세포의 리터. 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트. 전체 Iscove의 수정 된 둘 베코의 중간에 다시 판 2.5-3.0는 × 10 6 세포 / 판. 참고 : 세포를 도금 후 50 %의 합류 24-34 시간을 ~ 일 것이다. 그들은 ~ 50 % 융합 일 때 세포를 형질. 3. (5 일) CaPO4 형질 감염 및 바이러스 성 입자 컬렉션 기존의 미디어를 흡입하고 미리 예열 Iscove의 수정 된 둘 베코의 중간 10 ㎖를 추가하여 이전에 형질 전환에 미디어 2 시간을 변경합니다. 10 센티미터 판 미디어 10ml를 정확히이 있는지 확인하십시오. 2, 5 ㎖의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브를 사용하여 2 요리에 대한 형질 전환 시약을 준비합니다. 제 1 튜브 "DNA"및 제 2 튜브 "2X HBS를"레이블. pH가 7.4에서 트리스 – EDTA에 / μl를 1μg하는 DNA의 농도를 조정합니다. 렌티 바이러스를 들어, 천천히 이동 벡터의 20 μL (비라 추가관심 L 구조체) CMVdelta8.9 13 μL, VSV-G 9 μL, 분자 생물학 등급 H 2 O 860 μL, 제 1 튜브 ( "DNA") 2.5 M CaCl2를 100 ㎕ 연속적으로 탭핑하면서 튜브에 혼합합니다. 레트로 바이러스의 경우, CMVdelta8.9 플라스미드를 생략합니다. "DNA"로 표시된 튜브에 20 μl를 전송 벡터, 15 μL의 VSV-g, 860 ㎕의 분자 생물학 학년 H 2 O, 100 ㎕의 2.5 M CaCl2를 추가합니다. 배 HEPES 완충 식염수 1 ㎖ 추가 (산도 7.0,이 pH가 절대적으로 중요하다) "2X HBS"로 표시된 튜브. 천천히 "2X HBS"관에 한 번에 한 방울을 "DNA"튜브의 1 ml의 내용을 추가한다. 은 "DNA"튜브의 내용을 추가하는 동안 지속적으로 인덱스 또는 중간 손가락으로 "2X HBS"튜브를 누릅니다. 각 드롭 후 알 카포 4 소포를 관찰한다. 실온에서 30 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션 튜브. 하룻밤에 37 ° C를 부화 후, 각 10cm 셀 판에 느린 방울의 형질의 1 ML을 추가합니다. (주 6) Iscove의 수정 된 둘 베코의 중간 + 0.5 % FBS 8 mL 및 40 mg의 카페인 / 100 ㎖ 미디어와 미디어를 교체합니다. 전송 벡터는 형광 마커를 포함하면, 형광 발현이 성공적으로 형질을 나타냅니다. (주 7)은 10 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여 바이러스 입자를 함유하는 매체를 수집하고, 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 분주. 4 ° C에서 50 ML 원뿔 튜브를 저장합니다. 각각의 판에 0.5 % FBS 매체의 8 ML을 추가합니다. (주 8) 또, 바이러스 입자를 함유하는 매체를 수집하고 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 전날 수확 결합. 4. 농도 및 바이러스 정제 이 O. DDH을 40 % 폴리에틸렌 글리콜 6000 및 1.5 M의 NaCl을 첨가하여 5 배의 폴리에틸렌 글리콜 6000 용액을 의 솔루션을 압력솥121 ℃에서 45 분 동안 액체 사이클. 냉각 할 때 천천히 솔루션을 섞는다. 참고 :이 솔루션은 흐린 시작하고 냉각하는 것에 분명해질 것이다. 불용성 물질을 펠렛하기 위해 10 분 동안 2,000 XG에 바이러스 상등액 모두 모음을 함유하는 50 ml의 원추형 원심 분리 튜브. 0.45 μm의 낮은 단백질 결합 주사기 필터 (PES 또는 PVDF)를 통해 필터링하여 바이러스 미디어를 정화. 5 배 폴리에틸렌 글리콜에게 미디어 6000 솔루션을 추가 (최종 농도는 8 % 폴리에틸렌 글리콜 6000 및 0.3 M NaCl을해야한다). 튜브를 여러 번 (안 소용돌이을) 반전 섞는다. 때때로 리믹스 12 시간 이상 4 ℃에서 바이러스 함유 폴리에틸렌 글리콜 용액을 인큐베이션. (주 9) 원심 분리기 45 분 동안 2,500 XG에 바이러스가 포함 폴리에틸렌 글리콜 솔루션입니다. 제거하고 상층 액을 버리고 2 분간 다시 스핀. 다시 제거하고 상층 액을 버린다. 320 μL를 첨가하여 펠렛을 재현 탁멸균 인산 완충 생리 식염수는 하룻밤에 4 ° C를 품어 (320 μL은 1/100 수집 된 바이러스 함유 미디어의 원래 볼륨의 일이다). 선택적으로, 30 분간 로커에 상온에서 펠렛을 재현 탁. 펠렛을 다시 중단 한 후, 나누어지는 바이러스 (5 ~ 10 ㎕를 0.5 ml의 당 관) 및 -80 ° C (극적으로 역가를 줄일 4 ° C에서 해동 또는 저장 동결)에서 분취 액을 동결. 즉, 표준 프로토콜을 사용하여 바이러스 역가, HEK293T 세포를 6 웰 플레이트에서 일련의 희석을 수행하여 수동으로 48 시간 후 형광 콜로니를 카운트. CRISPR 바이러스 5. 시험 효능 참고 : 다음 단계를 사용하여 순서 클론 마우스 Neuro2A 세포를 사용 NHEJ 수리 이중 가닥 나누기의 생산을 테스트합니다. 이는 변형 된 세포의 비율 및 성질을 결정하는 데 사용될 수 있다는 점에서 측량 분석 위에 이점을 갖는다NHEJ으로 인한 삽입과 삭제의. 이러한 매트 리겔과 같은 젤라틴 코트 단백질 혼합물 3.5 cm 세포 배양 접시 Iscove 개변 둘 베코 배지 1:50 희석하고, 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다. 젤라틴 단백질 혼합물을 기음과 Neuro2A 세포를 접시. Neuro2A 세포가 50 %의 합류에 도달 한 후, 10의 감염의 다양성에 CRISPR의 Lentivirus 또는 레트로 바이러스를 추가 (즉, 셀 당 10 바이러스 입자). 참고 : HEK293 세포이기 때문에 Neuro2A 세포가 감염으로 붙임성없는, 따라서 하나의 감염은 세포가 렌티 바이러스에 감염되고 100 %가 발생하지 않습니다. 또한, 레트로 바이러스는 세포를 분할 감염 때문에도 100 % 감염 발생하지 않습니다. 감염의 거의 100 %의 비율을 달성하기 위해, 바이러스의 첨가는 필요에 따라 세포를 분리, 여러 날에 반복 될 수있다. 대안 적으로, 형광 양성 세포는 형광 활성화 세포 정렬을 이용하여 분리 될 수있다. 일렌티 바이러스와 100 % 감염률을 달성하기 위해 예를 가장 효과적인 방법은 FACS 분리 하였다 단일 감염을 수행한다. 레트로 바이러스의 경우, 24 시간 떨어져 감염의 4 라운드를 수행하고 100 % 감염을 보장하기 위해 FACS 분리에 의해 따릅니다. 1 주간 세포를 감염 후, 10 센티미터 접시에 가까운 합류로 세포를 확장하여 미디어를 대기음, 인산염 완충 식염수 5 ㎖로 접시를 씻으십시오. 0.25 % 트립신 1 ML을 추가하고 세포가 판을 들어 올릴 때까지 37 ° C에서 품어. 0.25 % 트립신 반응을 중화하고 1.5 ML 튜브에 세포를 피펫하고 5 분 동안 500 XG에서 세포를 펠렛 Iscove의 수정 된 둘 베코의 중간의 0.5 ML을 추가합니다. 세포를 다시 정지하고 95 부화 50 mM의 수산화 칼륨을 100 μL를 추가 DNA를 분리 5 분 동안 C를 °. 1 M 트리스, pH는 8.0의 10 μL를 사용하여 상기 용액을 중화. PCR은 CRISPR sgRNA의 대상이 게놈 영역을 측면 영역을 증폭사용 ~ DNA를 300 ng의 높은 충실도 PCR 마스터 믹스 4를 사용 단계 5.5입니다. 이러한 겔 DNA 복구 키트로서 2.5 % 아가 로스 겔 겔 겔 정제 키트를 사용하여 적절한 크기의 단편을 정제에 대한 PCR 반응을 실행. 을 pGEM-T 쉬운 등의 PCR 클로닝 벡터에 결찰하고 유능한 세포를 9로 변환. 24 시간 후, 15 mL의 둥근 바닥 튜브뿐만 아니라 적절한 항생제 (암피실린, 네오 마이신 등)에 LB 배지 2 ㎖를 추가한다. LB 플레이트에서 하나의 식민지를 선택 멸균 피펫 팁 또는 루프를 사용하여 개별 식민지 튜브를 접종한다. 확장하고 250 RPM, 24 시간 동안 37 ° C에서 튜브를 흔들어 식민지를 성장. 원하는만큼의 식민지에 대해 반복합니다. 미니 프렙 키트를 사용하여 E.로부터 DNA를 분리 콜라이 마우스 게놈 Cas9 대상 영역을 분석하기 위해 sgRNA 의해 표적 유전자의 영역을 증폭하기위한 프라이머 서열. 성인 마우스 6. 정위 주입 프로토콜 수술 준비 참고 : 그것은 생존 수술시 무균 상태를 유지하는 것이 중요하다. 이는 주입 부위를 소독 betadine를 사용하여 수술 도구를 살균하고 닫은 후 절개 부위에 항생제 연고를 추가 열에 의해서이 프로토콜에서 달성된다. 이는 멸균 장갑뿐만 아니라 충분히 멸균 수술 전용 영역을 사용하는 것도 중요하다. 열 소독 수술 도구 고압 증기 멸균 또는 사용 뜨거운 구슬 살균기 중 하나에 의해 사용하기 전에. 수술 및 복구하는 동안 체온을 유지하기 위해 가열 패드를 켜서 복구 실 및 수술 영역을 준비합니다. 주입을위한 두개골에 구멍을 만드는 데 사용되는 드릴을 조립합니다. 로드 멸균 PCR 튜브에서 직접 바이러스를 회수하여 주사 바늘로 바이러스의 4 μL. 간단히 얼음에서 바이러스 성 나누어지는을 제거합니다. 바이러스를 유지주사 전에 더 이상 1 시간 동안 실온에서 주사기이다. 7. 정위 주입 수술 제품군에 환기가 적절한 공기 흐름을 보장하기 위해 열려 있는지 확인합니다. 유도 챔버에서 4 % 이소 플루 란으로 마취로 수술 마우스를 준비합니다. 마취 후, 주사 부위를 준비 면도 헤드. 혀를 아래로 이동 핀셋을 사용하여 측면에 정위 장비에서 마우스를 놓습니다. 치아가 다음 슬롯에 드롭 귀 막대를 고정 할 때까지 입에 물린 줄을 삽입합니다. 마우스의 몸이 가열 패드에 있고 코는 코 콘에 위치해 있는지 확인합니다. 코 콘에 직접 4 % 이소 플루 란. 핀셋으로 발을 곤란하게하고 더 놀라게 반사가 없음을 확인하여 마취를 확인합니다. 눈을 윤활 인공 눈물을 적용합니다. 마침 POV의 교류 원으로 면도 헤드를 보라고하여 주사 부위를 준비Idone은 요오드와 리도카인. 메스를 사용하여 두피의 중심을 따라 작은 절개를 잘라. 브레 그마를 시각화하기 위해 필요한 경우 면봉과 과산화수소와 두개골을 건조. 해부 범위를 사용하여 두개골에 브레 그마를 찾아 브레 그마에 드릴 팁을 배치합니다. 제로 (또는 기록)은 X, Y 및 Z 평면에서 디지털 정위 좌표. 헤드 Y 축 꼬리 지느러미하는 입쪽의 레벨이되도록하기 위하여, 람다에 드릴 용 비트를 배치하고, Z 좌표는 브레 그마 및 람다 모두 대략 동일하도록 헤드 수평. 헤드가 x 축에 수평이되도록하기 위해, Y = 1/2 람다에 드릴 용 비트를 배치했다. 는 z 좌표 있는지 확인하는 것은 시상 봉합의 각면 (X = +/- 1mm)에 1mm에서 동일하다. 에 차이가있는 경우 두개골을 조정 왼쪽과 람다의 오른쪽에 1mm에서 z는 좌표입니다. 원하는 좌표를 통해 훈련을 놓습니다. 치아 이랑 (dentate gyrus)의 경우, 좌표 사용하십시오싸이는 브레 그마 및 X = +/- 1.1에서 -1.9을 =. 드릴링하기 전에, 다음, 천천히, 조심스럽게 두개골을 드릴, 2 %로 이소 플루 란을 낮 춥니 다. 모든 구멍을 천공 한 후, 정위 기기에 충전 된 주사기를 부착합니다. 시각적으로 구멍을 통해 주사기 센터와 z는 두개골 좌표 제로. 천천히 깊은 Z-깊이 주사기를 내립니다. 치아 이랑 (dentate gyrus)의 경우, Z 깊이는 -2.5, -2.4 및 -2.3이다. 정위 인젝터를 사용하여 0.25 μL / 분의 속도로 주사를 시작한다. 주입이 가장 낮은 Z-깊이를 완료 한 후, 다음 좌표 다음에 올리고 다시 주입을 시작, 1 분을 기다립니다. 모든 Z-주입 좌표가 주입 될 때까지이 패턴을 계속합니다. 마지막 주사 후 주사기를 제거하기 전에 2 분을 기다립니다. 참고 : 어떤 부작용이 마우스 뇌의 반구 당 바이러스의 2 μL까지 주입하여 조직에 언급되지 않았다. 다른 구멍 구멍 반복 주입. 주입 후, 정위 악기에서 마우스를 제거하고 6-0 실크 봉합과 두피를 봉합. 리도카인과 상처에 항균 크림을 적용합니다. 통증을 관리하는 IP 경로를 통해 0.8-1.0 ml의 생리 식염수 + 케토 프로 펜 (3-5 ㎎ / ㎏)을 주입한다. 가열 복구 챔버에 마우스를 놓습니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 동물을 반환하지 않습니다. 수술 다음 날에, 매일 마우스의 무게와 부드러운 음식과 간식을 제공합니다. 상처를 확인하고 일반 조건 / 태도를 확인합니다. 정위 주사 후, 마우스를 슬라이스 준비 전기 생리학 1 안락사 또는 관류 뇌 제거, 분리 및 분석 10 면역 염색을 통해 할 수있다.