Tasarımı, Ambalaj ve Yüksek Titre CRISPR Retro ve Lentivirüslerden teslimi Stereotaksik enjeksiyon yoluyla
Özet
CRISPR / Cas9 sistemi bilimsel topluluk hedeflenen genom düzenleme erişilebilir ve uygun fiyatlı hale getirmek için potansiyel sunmaktadır. Bu protokol CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak ilgilenilen geni nakavt, sonra yetişkin fare beyninin içine stereotaxically onları enjekte edecektir virüsleri oluşturmak için nasıl göstermek için tasarlanmıştır.
Abstract
Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism’s genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.
Introduction
normal fizyoloji ve hastalık patolojisinin temel incelemek için, hassas bir model organizmada gen ekspresyonu işlemek için bir ihtiyaç vardır. ilgi konusu bir genetik eleman, bir rekombinaz tarafından tanınan bölgeleri tarafından takviye edilir, burada, memeli bir model organizmalar için, bu, büyük ölçüde oluşturma ve transgenik farelerin gelişimi üzerinde odaklanmaktadır. Bu durum, bu iki yanında bir gen alana özgü manipülasyon neden olabilir. Bu başarılı bir strateji olsa da, zaman ve kaynak yoğun olduğu; Örneğin, bir floxed gen Cre rekombinaz ve Cre raportör geni ifade olan bir üç transjenik hayvan oluşturma çok çiftleşmesi ve onay gerektirmektedir. Bunun aksine, bir replikasyon stereotaksik enjeksiyonu floxed geni hayvana floresan protein ve rekombinazı kodlayan kusurlu viral parçaları, karmaşık genotipleme veya üretme stratejilerinin 1 gerektirmez. virüs eksprese eden bir floresan protein ve Cre ise Bundan başka, ikinci bir virüs Enco ile birlikte enjekte edilirDing, farklı bir flüoresan proteini, bu hedef genetik manipülasyonu için bir mesafede olan doku kontrolü sağlar. Bu strateji hala knock-in hayvanların kullanılmasını gerektirir iken, viral aracılı RNA temelli stratejiler transgenik hayvanların ihtiyacını aşmak. Örneğin, bir flüoresan protein ve kısa bir saç tokası RNA (shRNA) kodlayan replikasyon eksikli virüsleri stereotaksik enjeksiyonu ilgi konusu bir genin kopyasının güçlü bir azalmaya neden hücrenin endojen RNAi amaçlı kullanılabilir. Ancak, shRNA stratejileri genellikle mütevazı hücresel fenotipleri 2 sonuçlanan ince gen knock-çıkışlar üretir. bir knock-down daha fizyolojik heterozigot gen disfonksiyonu hakkında olsa da, onun azalmış sağlamlığı bir knock-out ile karşılaştırıldığında yeni genlerin fenotipik keşif için ideal değildir.
Son zamanlarda ortaya çıkan üçüncü bir tekniktir, ilişkili CRISPR-(Düzenli interspaced Kısa palindromic Tekrar Kümelenmiş) CRISPR / Cas9 (Protein 9) sistemi, bir küçük dışsal RNA ve DNA kesme enzimi hem ekspresyonuna dayanır. CRISPR / Cas9 sistemi yabancı tanımlayan virüs DNA istila ve Cas9 enzimi 3,4 vasıtasıyla bozulmaya için hedeflenmesi için bir yöntem gelişti prokaryotik bağışıklık sistemi için uyarlanmıştır. Bu güçlü genom düzenleme tekniği hedeflenen silmeler, girmeler ve mutasyonları oluşturmak için kullanılabilir; Aşağıdaki protokol, in vivo ifadesini nakavt için ilgi konusu bir gen silme işlemi yapmak için nasıl özetleyecek. Cas9 enzimin bir skafold RNA ile ilgili bölge ile homolog ve bitişik bir kılavuz RNA ile ifade edilmelidir. Bu tekniği kullanarak bir genin nakavt sentetik kılavuz RNA'lar (sgRNA) kullanarak genomunda belirli bir bölgeye Cas9 hedefleyen ve ilgi yerinde çift iplikli sonları (DSBs) indükleyici gerektirir. Bu DSBs sonra homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) hangi le yoluyla endojen hücre onarım makine tarafından tamir ediliryanlış anlamlı veya anlamsız mutasyon üretebilir ve bu nedenle fonksiyonel protein ifade 5 kaybına oluşturabilirsiniz indellerin reklam. Bu sistem genomik değişiklikler üretir, çünkü sadece Cas9 ve sgRNA geçici ifadesini gerektirir. sabit bir flüoresan göstergesi bu şekilde manipüle hücreleri ve soyu tespit etmek için Ancak, arzu edilir.
Lenti- ve retrovirüsler kararlı bir şekilde, uzun süreli ekspresyonunu korumak ve mitoz sırasında yavru hücrelere aşağı geçirilir konakçı hücrelere, ilgi konusu DNA'yı entegre avantajına sahiptir. Bu protokol tasarım ve replikasyon kusurlu hale, yüksek titre retrovirüslerin iki tip üretimini tarif etmektedir: insan bağışıklık eksikliği virüsü kaynaklı lentiviral partiküller (lentivirüs) ve murin Maloney Lösemi virüsü (retrovirüs) dayananlar. Bu virüslerin her iki stabil büyük transgenlerin ifade destekleyebilen olsa da retroviral parçacıklar, sadece genomun du entegre olabilirBu nedenle nükleer zarfın bozulması ve halka hücre bölünmesi bir etiket aracı ve doğum tarihini hücreleri 6 olarak kullanılabilir. Lentiviruses viral toplama sırasında kafein 8 kullanımı dahil nispeten düşük titre 7, bu metodoloji, olduğu için bir üne sahip olsa da, rutin 10 9 ve 10 10 parçacıklar / ml titreleri üretir. lenti- ve retrovirüsler diğer bir avantajı, çok büyük parçaları için tolerans. protokolleri takip toplama flüoresan raportör, sgRNAlardır ve Cas9 DNA değiştirme gibi bir flüoresan proteini ifade etmek üzere CRISPR / Cas9 sistemi kullanmak için kodlayan bir lenti tasarımı veya retrovirüs prosedürü özetlenmektedir.
Fare stereotaksik nöroşirürji morfolojisi, fonksiyon ve enfekte nöronların bağlantı incelemek için in vivo virüs enjekte etmek için değerli bir yöntemdir. nöronlar viral enfeksiyonun tim uzun bir süre boyunca ifade seviyelerini değiştirmek için kullanılabilirBu gelişim boyunca e, ve sentezleme tam olarak çeşitli ilaç uyarılabilir sistemler ve spesifik Cre tahrik ifade kullanımı ile kontrol edilebilir. Bu özel protokol bir yetişkin fare beyninde ilgilenilen geni nakavt bir sgRNA ve Cas9 ifade eden bir virüs enjekte açıklar. Fareler 48 saat sonrası enjeksiyon içinde görülebilir, viral transgenin bu prosedür ve ifadeden çok hızlı iyileşir. Bununla birlikte, florofor sentezleme 3 hafta sonrası enfeksiyon yakınındaki maksimal seviyeleri ile sonuçlanan hafta boyunca arttırır. Viral stereotaksik enjeksiyonu tabi Fareler davranış, elektrofizyoloji, ya da morfolojik çalışmalar için de kullanılabilir. Genel olarak, bu prosedürlerin amacı stereotaksik cerrahi ve belirli bir sgRNA ve Cas9 ifade eden bir virüs kullanılarak yetişkin fare beyninde bir gen nakavt nasıl göstermektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarılı viral paketleme için önemli olan bir kaç kritik adımlar vardır. sağlıksız hücreleri büyük ölçüde üretilen virüs miktarını azaltacaktır gibi hücre sağlığı, öncesi ve transfeksiyon sırasında önemlidir. transfeksiyon ve paketleme başarılı olursa, o zaman hücrelerin% 100 fluorofor ifade etmelidir ve hücreler fonksiyonel Sinsityum oluşturmalıdır. Aşama 3.2.4, boru çekme verimli, yüksek titre transfeksiyonu için gerekli olan ve HEPES-tamponlu tuzlu su pH kesin olmalıdır. Viral paketleme için gerekli plazmidler üretmek maksi prepler derece saf olması gerekir. Bu noktaya kadar, son DNA yıkanmasının çökeltilmesi etanol ve Tris-EDTA tamponu içinde yeniden askıya yararlıdır. Kafein, viral alınan güne 6 (basamak 3.4) üzerine ilave edilir olduğu ortam içinde% 2 ya da daha düşük serum miktarını azaltmak için de çok önemlidir. Serum düşük değilse, o zaman son saflaştırılmış virüs serum prot istenmeyen bir miktarda ihtiva edecektirein. polietilen glikol viral partikülleri çökeltme 6000 kullanımı ultra-santrifüj gerekliliğini hariç tutar. Cas9 CRISPR içeren virüsler genellikle sadece bir fluorofor içeren virüsler kat daha az yaklaşık 10 bir titreye sahip olduğunu not etmek de önemlidir.
stereotaksik cerrahi için, inhale anestezi kullanımı enjektabl anestezik kıyasla hızlı ve hassas kontrol veya hayvanın bilincini izin verir ve daha geniş bir yaş aralığında anestezi sağlar. Temiz ve steril cerrahi aletler tutmak son derece önemlidir ve tekrarlanabilir hedefleme kafasının hassas konumlandırma gerektirir. stereotaksik alet ve kafatası sıkıca hissediyor başın gözleyin ya da haddeleme olduğundan emin olun. Kafatası stereotaksik koordinatlarını belirlemek için sütür bulmak için kuruması için yararlı olabilir. Ayrıca, koordine stereotaksik her hızı ve hacim ampirik olarak tespit edilmelidir.
Bu teknik, (AAVler) .Bu nedenle adeno-bağlantılı virüs ile karşılaştırıldığında, bir lenti- veya retrovirüs yayılması özellikle kısıtlı bir ayrık beyin bölgesi enfekte olduğunda, bu virüsler değerlidir, fakat genel olarak bulaşmasına AAVler ile ilişkili değil de sınırlayan hayvanlarda davranış analizi için kullanılmıştır. Bu protokolde kafein kullanımı büyük ölçüde bu virüslerin titresi artar, ama yine de AAV ambalaj elde titreleri gibi yüksek değildir. Ayrıca, geçici olarak transfekte zaman CRISPR / Cas9 istikrarlı genomik düzenlemeler bile formları olarak stabil entegrasyon florofor ifade sadece bir avantaj olduğunu ve bunun mümkün olduğunu devam eden sonunda hedef etkiler kapalı üretebilir Cas9 ve sgRNA ifadesini. AAVler ile CRISPR / Cas9 sistemi hücre bölünmesi üzerinden gerçekleştirilen genomik değişiklik sağlamak için yeterli olan geçici ifade, ancak, flüorofor sentezleme devam edilmez.
len oluşturulmasıTi ve CRISPR / Cas9 sistemini kullanan retrovirüsler organizmaların geniş bir yelpazede herhangi bir yeni genin hedeflenmesi yeteneği vermek olacaktır. Gen düzenleme etkinliği Cas9 bölünmesini hedefleme kılavuz RNA sekansına bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. Deneysel dizileme Neuro2A hücreleri enfekte sonrası 10 ila% klonların% 80 indeller içeren olduğu tespit edilmiştir. Neuro2A hücrelerinde hesaplanan Indel frekansları nöronların bu yansıtıcı olup bilinmemektedir. Böyle Benchling olarak rehberlik RNA tasarım yazılımı artık belirli bir hedef dizinin etkinliğini tahmin etmek mümkün olabilir bir "on-hedef" puan içerir. Bu tür "on-hedef" puanları daha yaygın uygulanan olur ampirik CRISPR-Cas9 sistemi olarak nöronlar ve diğer hücre türleri belirlenecek güvenilir ihtiyaçlar için ne derece.
Lentivirüs tabanlı transgenik hayvan üretimi lentivirüs-teslim transgenlerin si haline raporları ile değişken başarılı olmuştur11 lenced. DNA CRISPR aracılı gen düzenleme bütün hayvan modelleri oluşturmak için mikrop hattı üzerinden geçirilebilir. Böylece, istikrarlı genomik düzenleme viral teslim fluorophores ve Cas9 transgenlerin susturma rağmen elde olabilir. Bu hedef genomik değişiklikler için etkin bir platform sağlayabilir. CRISPR / Cas9 sisteminin viral teslimat, transgenik organizmalar gerekmeyen iken, bu tekniklerin tamamlayıcıdır. Örneğin, indüktif genetik manipülasyonlar ve nöronal aktivitenin arasındaki ilişkinin içine karmaşık çalışmaları kolaylaştırmak gerektiğini Cre ve Cre bağımlı opto veya kemoterapi-genetik transgenlerin ifade eden bileşik transgenik hayvana böyle viral partikülleri enjekte. İkinci bir örnek, gen gen etkileşimleri taranması için bir girişim bir koşullu nakavt içine bu Cas9 / sgRNA viral partikülleri sunmaktır. Son olarak, bu araştırmanın bir başka heyecan verici rota hasta türetilmiş hücrelerde fenotip ve tedavi bileşiklerin tarama, hangi can olandoğrulamak ve çeşitli hastalıklarda bozulur genetik ağları bulmak için kullanılabilir.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma R01MH097949 hibe Ninh tarafından desteklenen ve Otizm bwl ve Norris Pamuk Kanser Merkezi Optik Görüntüleme Paylaşılan Enstrümantasyon Grant P30CA023108 Pilot Grant 7359 konuşur.
Materials
| List of Cell Culture Reagents | |||
| 293FT cell line | Life Technologies | R700-07 | For Lentivirus |
| 293GP cell line | Clontech | 631458 | For Retrovirus |
| Iscove's Modification of DMEM (IMDM) | Corning | 10-016-CV | Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and 1% P/S |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| MEM Nonessential Amino Acids (NEAA) | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine solution, 100X (L-Gln) | Corning | 25-005-CI | |
| Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S) | Corning | 30-002-CI | |
| Polystyrene 10cm plate | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-053-CI |
|
| Reagent | Company | Catalog Number | Notes |
| List of Transfection Reagents | |||
| 5ml polystyrene tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Scientific | C69-500 | Make a 2.5 M solution in ddH2O |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP2939-100 | |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher Scientific | S369-500 | |
| (Na2HPO4) | |||
| 2X HEPES Buffered Saline (HBS) | 500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!) | ||
| filter and store at 4°C | |||
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-5G | |
| 0.22 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLGV033RS | |
| 0.45 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLHP033RS | |
| 60CC L/L Syringe | Med-Vet International | MV60CCLL | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 352098 | |
| polyethylene glycol 6000 (PEG 6000) | Millipore | 528877 | |
| (10X) Phosphate Buffered Saline (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1605-0000 | |
| Matrigel | Fisher Scientific | CB-40230A | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC41678-5000 | |
| Donor Horse Serum | Cellgro | 35-030-CV | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| 10ml serological pipette | Fisher Scientific | 357551 | |
| anti-GFP, rabbit, 488 conjugate | Invitrogen | A21311 | |
| Reagent | Company | Catalog Number | Notes |
| Stereotaxic Surgery Reagents | |||
| Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx | Med-Vet International | 1CCVLS | |
| Isoflurane | |||
| Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk | Med-Vet International | JOR580S | |
| artificial tear ointment | Med-Vet International | RXPARALUBE-O | |
| PVP PrepSolution | Med-Vet International | HPIV108208H | |
| normal saline | Med-Vet International | DYND500MLSH | |
| cotton tipped applicators | Med-Vet International | CTA6 | |
| Triple antibiotic ointment | Med-Vet International | RXTRIP-OI15 | |
| MONOJECT® Needles Soft Pack 25g x 5/8" | Med-Vet International | 25058 | |
| 6-0 silk sutures | Med-Vet International | MV-711 | |
Referanslar
- Williams, M. R., DeSpenza, T., Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive. J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).
- Luikart, B. W., et al. Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells. J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Luikart, B. W., et al. miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus. PLoS One. 6 (5), e19077 (2011).
- Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
- Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
- Fricano, C. J., et al. Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons. Front Mol Neurosci. 7, 30 (2014).
- Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?. Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
