تصميم والتعبئة والتغليف، وتسليم العليا العيار الحجمي كريسبر الرجعية وLentiviruses عبر التجسيمي الحقن
Özet
يوفر نظام / Cas9 كريسبر القدرة على جعل الجينوم استهدفت تحرير سهولة وبأسعار معقولة للمجتمع العلمي. ويهدف هذا البروتوكول إلى شرح كيفية إنشاء الفيروسات التي سوف بالضربة القاضية جين الاهتمام باستخدام نظام / Cas9 كريسبر، ثم ضخها stereotaxically في دماغ الفأر الكبار.
Abstract
Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism’s genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.
Introduction
لدراسة أساس من علم وظائف الأعضاء الطبيعي وعلم الأمراض، هناك حاجة إلى التعامل بدقة التعبير الجيني في الكائنات نموذج. للكائنات نموذج الثدييات، ويتركز هذا إلى حد كبير على إنشاء وتطوير الفئران المعدلة وراثيا حيث يحيط عنصر وراثي من الفائدة عن طريق مواقع معترف بها من recombinase. هذا يمكن أن يؤدي إلى التلاعب بكل موقع من هذه الجينات يحيط. في حين أن هذا كان استراتيجية ناجحة، فقد حان الوقت والموارد مكثفة. على سبيل المثال، وخلق الحيوانات المعدلة وراثيا الثلاثي التي من شأنها التعبير عن الجينات floxed، لجنة المساواة العرقية recombinase، وجين مراسل لجنة المساواة العرقية يتطلب التزاوج متعددة والتحقق من الصحة. في المقابل، فإن حقن التجسيمي النسخ المتماثل الجسيمات الفيروسية المعيبة ترميز البروتين الفلوري وrecombinase إلى حيوان الجينات floxed لا يتطلب التنميط الجيني معقدة أو استراتيجيات التربية 1. وعلاوة على ذلك، إذا كان البروتين الفلوري ولجنة المساواة العرقية معربا عن الفيروس شارك حقنه مع ENCO فيروس الثانيدينغ بروتين فلوري مختلفة، ثم وهذا يوفر السيطرة داخل الأنسجة للتلاعب الجيني المستهدفة. بينما هذه الاستراتيجية لا يزال يتطلب استخدام الحيوانات تدق في واستراتيجيات RNA مقرها بوساطة فيروسي تحايل على الحاجة إلى حيوانات معدلة وراثيا. على سبيل المثال، حقن التجسيمي من الفيروسات تكرار نقص تكود بروتين فلوري والحمض النووي الريبي قصيرة دبوس (shRNA) يمكن استخدام الآلات رني الذاتية للخلية أن يؤدي إلى انخفاض قوي للنسخة من الجين من الفائدة. ومع ذلك، استراتيجيات shRNA تنتج الجينات خفية تدق هبوطا في كثير من الأحيان مما أدى إلى الظواهر الخلوية المتواضعة 2. في حين أن تدق إلى أسفل قد يكون أكثر من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة لمعالجة العجز الجينات متخالف، متانة في انخفاض مقارنة لالضربة القاضية، ليست مثالية لاكتشاف المظهري للجينات جديدة.
وهناك تقنية الثالثة التي ظهرت في الآونة الأخيرة، وكريسبر (مجمع Interspaced بانتظام كرر المتناوب قصير) / Cas9 (كريسبر المصاحبالبروتين 9) النظام، تعتمد على التعبير عن كل من الحمض النووي الريبي خارجي صغير وإنزيم قطع الحمض النووي. تم تعديل نظام / Cas9 كريسبر من نظام المناعة في بدائيات النواة التي تطورت وسيلة لتحديد أجنبي، غزو الحمض النووي من الفيروسات واستهداف ذلك لتدهور عن طريق انزيم Cas9 3،4. هذا قوية تقنية تحرير الجينوم يمكن استخدامها لخلق الحذف المستهدفة، الملاحق، والطفرات. وبروتوكول التالية سيوضح كيفية جعل الحذف في الجينات في المصالح من أجل خروج المغلوب التعبير في الجسم الحي. يجب أعرب انزيم Cas9 مع الحمض النووي الريبي دليل مثلي إلى المنطقة من اهتمام ومتجاورة مع RNA سقالة. خروج المغلوب من الجين باستخدام هذه التقنية يتطلب استهداف Cas9 إلى منطقة معينة في الجينوم باستخدام الرنا دليل الاصطناعية (sgRNA)، وحمل فواصل المزدوج تقطعت بهم السبل (DSBs) في موقع من الفائدة. ثم يتم إصلاح هذه DSBs بواسطة آلية خلية إصلاح الذاتية عن طريق غير مثلي (NHEJ)، الانضمام نهاية التي جنيهإعلان لindels التي قد تنتج مغلطة أو هراء الطفرات وبالتالي يمكن إنشاء فقدان بروتين تعبير وظيفي 5. لأن هذا النظام ينتج التعديلات الجينوم، فإنه يتطلب فقط التعبير عابرة للCas9 وsgRNA. ومع ذلك، فمن المستحسن لمؤشر الفلورسنت مستقر لتحديد الخلايا وذريتها التلاعب بهذه الطريقة.
Lenti- والفيروسات لديها ميزة دمج مستقر الحمض النووي للاهتمام في الخلايا المضيفة التي تحافظ على التعبير على المدى الطويل، وتنتقل إلى الخلايا الوليدة أثناء الانقسام. يصف هذا البروتوكول تصميم وإنتاج نوعين من تكرار معيب، الفيروسات القهقرية عيار عالية: فيروس نقص المناعة البشرية المستمدة الجسيمات lentiviral (الفيروسة البطيئة) وتلك القائمة على الفئران مالوني اللوكيميا فيروس (الارتجاعي). في حين أن كلا من هذه الفيروسات قادرة على دعم معربا مستقرة من الجينات المحورة كبيرة، يمكن للجسيمات فيروس الاندماج في الجينوم دو فقطانقسام الخلايا حلقة مع تدهور الغلاف النووي، وبالتالي يمكن أن تستخدم كأداة لتسمية والخلايا الولادة تاريخ 6. في حين lentiviruses لها سمعة لكونها منخفضة نسبيا عيار 7، هذه المنهجية، بما في ذلك استخدام الكافيين 8 خلال جمع الفيروسي، وتنتج بشكل روتيني التتر من 10 9 و 10 10 الجسيمات / مل. ميزة أخرى لlenti- والفيروسات هي التسامح لإدراج كبيرة جدا. مجموعة التالية من بروتوكولات يحدد الإجراء لتصميم lenti أو الارتجاعي ترميز مراسل فلوري، sgRNAs، وCas9 للاستفادة من كريسبر نظام / Cas9 لتعديل الحمض النووي وكذلك التعبير عن بروتين فلوري.
الماوس جراحة المخ والأعصاب التجسيمي هو طريقة قيمة لحقن الفيروسات في الجسم الحي لدراسة التشكل، وظيفة، والتواصل بين الخلايا العصبية المصابة. عدوى فيروسية في الخلايا العصبية يمكن استخدامها لمعالجة مستويات التعبير على مدى فترة طويلة من تيمالإلكترونية، مثل جميع أنحاء التنمية، والتعبير يمكن أن تسيطر على وجه التحديد من خلال استخدام مختلف النظم محرض المخدرات وتحديدا لجنة المساواة العرقية التعبير مدفوعة. يشرح هذا بروتوكول معين كيفية حقن فيروس إبداء sgRNA وCas9 إلى بالضربة القاضية جين من الفائدة في دماغ فأر بالغ. الفئران على التعافي بسرعة جدا من هذا الإجراء والتعبير عن التحوير فيروسية يمكن أن ينظر إليه غضون 48 ساعة بعد الحقن. ومع ذلك، يظهر التعبير fluorophore زيادة على مدار أسابيع مما أدى إلى المستويات القصوى القريب من 3 أسابيع بعد الإصابة. الفئران التي تخضع لحقن التجسيمي فيروسية يمكن أن تستخدم في السلوك، الكهربية، أو الدراسات المورفولوجية. وعموما، فإن الغرض من هذه الإجراءات هو شرح كيفية بالضربة القاضية جين في دماغ الفأر الكبار باستخدام جراحة التجسيمي وفيروس تعبر عن sgRNA محددة وCas9.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة التي تعتبر مهمة للتعبئة الفيروسي ناجحة. الصحة الخلية الحيوية قبل وخلال ترنسفكأيشن، وخلايا غير صحية سوف يقلل كثيرا من كمية الفيروس المنتجة. إذا كان ترنسفكأيشن والتعبئة والتغليف ناجحة، ثم 100٪ من الخلايا يجب أن تعبر عن fluorophore وهذه الخلايا يجب أن تشكل مخلى الوظيفية. في خطوة 3.2.4، والتنصت على أنبوب هو ضروري لترنسفكأيشن ارتفاع عيار كفاءة، ودرجة الحموضة في مخزنة المالحة HEPES-يجب أن يكون بالضبط. و-محضرات ماكسي التي تنتج البلازميدات اللازمة لتغليف الفيروسي يجب أن تكون نقية للغاية. إلى هذه النقطة، فإنه من المفيد أن الإيثانول ترسيب الحمض النووي شطف النهائي وإعادة تعليق العازلة في تريس، EDTA. بل هو أيضا مهم جدا لتقليل كمية من المصل إلى 2٪ أو أقل في وسائل الإعلام أن تتم إضافة الكافيين إلى يوم 6 (الخطوة 3.4) قبل جمع الفيروسي. إذا لم يتم خفض المصل، ثم الفيروس النقي النهائي سوف تحتوي على كمية غير مرغوب فيه من البروتوكول الاضافي في الدمعين. استخدام البولي ايثيلين جلايكول 6000 عندما عجل الجسيمات الفيروسية يستبعد ضرورة تنبيذ فائق. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن كريسبر تحتوي على فيروسات Cas9 وعادة ما يكون عيار حوالي 10 أضعاف أقل من الفيروسات تحتوي على fluorophore فقط.
لعملية جراحية التجسيمي، واستخدام التخدير عن طريق الاستنشاق يسمح السيطرة السريعة والدقيقة أو وعي الحيوان مقارنة التخدير عن طريق الحقن، ويسمح التخدير أكثر من الفئة العمرية الأكبر. ومن المهم للغاية للحفاظ على الأدوات الجراحية نظيفة ومعقمة، واستهداف استنساخه يتطلب تحديد المواقع بدقة من الرأس. تأكد من وجود أي نصب أو المتداول الرأس في الصك التجسيمي وأن الجمجمة يشعر ثابتا في مكانه. يمكن أن يكون مفيدا للسماح الجمجمة حتى يجف من أجل العثور على خيوط لتحديد الإحداثيات التجسيمي. أيضا، فإن معدل وحجم لكل التجسيمي تنسيق يجب أن تحدد تجريبيا.
هذا الأسلوب يحد في أن انتشار lenti- أو الارتجاعي يقتصر، لا سيما بالمقارنة مع الفيروسات الغدة المرتبطة (AAVS). لذلك، هذه الفيروسات هي قيمة عندما تصيب منطقة الدماغ منفصلة، ولكن ليس للعدوى العام يرتبط مع AAVS تستخدم لتحليل سلوكي لدى الحيوانات. استخدام الكافيين في هذا البروتوكول بشكل كبير يزيد من عيار من هذه الفيروسات، لكنها لا تزال يست مرتفعة كما التتر التي تحققت في التعبئة والتغليف AAV. أيضا، التكامل مستقر هو فقط ميزة التعبير fluorophore، كما يشكل كريسبر / Cas9 التعديلات الجينوم مستقرة حتى عندما transfected عابر وأنه من الممكن أن الجارية تعبير عن Cas9 وsgRNA قد تؤدي في نهاية المطاف من آثار الهدف. التعبير عابرة للكريسبر / Cas9 النظام مع AAVS كافية لإنتاج التغيرات الجينية التي تم نشرها في جميع أنحاء انقسامات الخلية، ومع ذلك، لن يتم الإبقاء التعبير fluorophore.
إنشاء ليونسوف ti- والفيروسات باستخدام كريسبر / نظام Cas9 نقلها القدرة على استهداف أي الجينات رواية في مجموعة متنوعة واسعة من الكائنات الحية. تظهر كفاءة التحرير الجينات أن تعتمد على تسلسل الحمض النووي الريبي دليل استهداف انشقاق Cas9. وقد تم تحديد تجريبيا أن ما بين 10٪ و 80٪ من الحيوانات المستنسخة تحتوي على indels بعد إصابة التسلسل خلايا Neuro2A. ومن غير المعروف حاليا ما إذا كان الترددات INDEL حساب في الخلايا Neuro2A هي انعكاس لتلك الموجودة في الخلايا العصبية. توجيه RNA تصميم البرمجيات مثل Benchling تشمل الآن على درجة "على الهدف" التي قد تكون قادرة على التنبؤ كفاءة سلسلة هدف معين. إلى أي مدى هذه الدرجات "على الهدف" هي احتياجات موثوقة إلى أن تحدد تجريبيا في الخلايا العصبية وغيرها من أنواع الخلايا كنظام كريسبر-Cas9 يصبح تنفيذها على نطاق أوسع.
وكان الإنتاج الحيواني المعدلة وراثيا على أساس الفيروسة البطيئة ناجح بنسب مختلفة مع تقارير تفيد بأن الجينات المحورة التي ألقيت من الفيروسة البطيئة تصبح الاشتراكيةlenced 11. قد يتم تمريرها كريسبر التحرير الجينات بوساطة الحمض النووي من خلال خط الجرثومية لتوليد نماذج الحيوانية كلها. وبالتالي، قد يكون تحرير الجيني مستقر يمكن تحقيقه على الرغم من إسكات fluorophores الفيروسية التي ألقيت والجينات المحورة Cas9. وهذا قد تقدم منصة فعالة لإجراء تعديلات الجينومية المستهدفة. تسليم الفيروسية للنظام / Cas9 كريسبر، في حين لا تتطلب الكائنات المعدلة وراثيا، هي مكملة لتلك التقنيات. على سبيل المثال، عن طريق الحقن مثل هذه الجسيمات الفيروسية في الحيوانات المعدلة وراثيا مركب يعبر عن inducibly لجنة المساواة العرقية ولجنة المساواة العرقية opto- تعتمد أو الكيماوي الوراثية الجينات المحورة ينبغي أن تسهل دراسات معقدة في العلاقة بين التلاعب الجيني ونشاط الخلايا العصبية. والمثال الثاني هو تقديم هذه الجسيمات الفيروسية Cas9 / sgRNA إلى دور الستة عشر الشرطي في محاولة للكشف عن التفاعلات الجينات الجين. وأخيرا، والطريق مثير آخر من هذا البحث هو فحص الظواهر والمركبات العلاجية في خلايا المريض المشتقة، والتي يمكناستخدامها للتحقق من صحة واكتشاف شبكات الجينية التي تتعطل في مختلف الأمراض.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل نينه منح R01MH097949 والتوحد يتحدث الطيار غرانت 7359 إلى BWL ومركز نوريس القطن السرطان بصري التصوير الأجهزة المشتركة غرانت P30CA023108.
Materials
| List of Cell Culture Reagents | |||
| 293FT cell line | Life Technologies | R700-07 | For Lentivirus |
| 293GP cell line | Clontech | 631458 | For Retrovirus |
| Iscove's Modification of DMEM (IMDM) | Corning | 10-016-CV | Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and 1% P/S |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| MEM Nonessential Amino Acids (NEAA) | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine solution, 100X (L-Gln) | Corning | 25-005-CI | |
| Pennicillin/Streptomycin solution, 100X (P/S) | Corning | 30-002-CI | |
| Polystyrene 10cm plate | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | 25-053-CI |
|
| Reagent | Company | Catalog Number | Notes |
| List of Transfection Reagents | |||
| 5ml polystyrene tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Scientific | C69-500 | Make a 2.5 M solution in ddH2O |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP2939-100 | |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher Scientific | S369-500 | |
| (Na2HPO4) | |||
| 2X HEPES Buffered Saline (HBS) | 500ml: 8.2g NaCl, 5.95g HEPES, 0.106g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!) | ||
| filter and store at 4°C | |||
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-5G | |
| 0.22 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLGV033RS | |
| 0.45 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLHP033RS | |
| 60CC L/L Syringe | Med-Vet International | MV60CCLL | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 352098 | |
| polyethylene glycol 6000 (PEG 6000) | Millipore | 528877 | |
| (10X) Phosphate Buffered Saline (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1605-0000 | |
| Matrigel | Fisher Scientific | CB-40230A | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC41678-5000 | |
| Donor Horse Serum | Cellgro | 35-030-CV | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| 10ml serological pipette | Fisher Scientific | 357551 | |
| anti-GFP, rabbit, 488 conjugate | Invitrogen | A21311 | |
| Reagent | Company | Catalog Number | Notes |
| Stereotaxic Surgery Reagents | |||
| Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1cc luer slip T.B. 100/bx | Med-Vet International | 1CCVLS | |
| Isoflurane | |||
| Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk | Med-Vet International | JOR580S | |
| artificial tear ointment | Med-Vet International | RXPARALUBE-O | |
| PVP PrepSolution | Med-Vet International | HPIV108208H | |
| normal saline | Med-Vet International | DYND500MLSH | |
| cotton tipped applicators | Med-Vet International | CTA6 | |
| Triple antibiotic ointment | Med-Vet International | RXTRIP-OI15 | |
| MONOJECT® Needles Soft Pack 25g x 5/8" | Med-Vet International | 25058 | |
| 6-0 silk sutures | Med-Vet International | MV-711 | |
Referanslar
- Williams, M. R., DeSpenza, T., Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive. J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).
- Luikart, B. W., et al. Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells. J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Luikart, B. W., et al. miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus. PLoS One. 6 (5), e19077 (2011).
- Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
- Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
- Fricano, C. J., et al. Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons. Front Mol Neurosci. 7, 30 (2014).
- Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis?. Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
