Exon-Skipping ist derzeit vielversprechendsten Therapieoption für Duchenne-Muskeldystrophie (DMD). Um die Anwendbarkeit für DMD-Patienten zu erweitern und die Stabilität / Funktion der resultierenden verkürzten Dystrophin-Proteine, ein Multi-Exon-Skipping-Ansatz Cocktail Antisense-Oligonukleotide wurde zur Optimierung entwickelt und wir zeigten systemische Dystrophin-Rettung in einem Hundemodell.
Duchenne – Muskeldystrophie (DMD) ist eine der häufigsten tödlichen genetischen Krankheiten weltweit, verursacht durch Mutationen im Dystrophin (DMD) Gen. Exon-Skipping beschäftigt kurze DNA / RNA-ähnliche Moleküle, so genannte Antisense-Oligonukleotide (AON), die den Leserahmen wiederherzustellen und produzieren kürzer, aber funktionelle Proteine. Allerdings Exon-Skipping-Therapie steht vor zwei großen Hürden: begrenzte Anwendbarkeit (bis zu nur 13% der Patienten können mit einem einzigen AON Medikament behandelt werden), und unsichere Funktion der verkürzte Proteine. Diese Fragen wurden mit einem Cocktail AON Ansatz adressiert. Während etwa 70% der DMD-Patienten durch einzelne Exon-Skipping (alle Exons kombiniert) behandelt werden können, könnte man möglicherweise mehr als 90% der DMD-Patienten zu behandeln, wenn multiple Exons unter Verwendung von Antisense-Medikamenten Cocktail Überspringen realisiert werden kann. Der Eckzahn X-chromosomal-Muskeldystrophie (CXMD) Hundemodell, dessen Phänotyp ist ähnlich dem menschlichen DMD-Patienten wurde verwendet, um die systemische effic zu testenACY und Sicherheit des Überspringens Multi-Exon der Exons 6 und beherbergt 8. CXMD Hundemodell zu einem Mangel an Exon 7 in Dystrophin – mRNA eine Spleißstelle Mutation in Intron 6, führt. Zur Wiederherstellung erfordert das Leseraster in CXMD Multi-Exon-Skipping der Exons 6 und 8; Daher ist CXMD ein gutes mittelgroße Tiermodell die Wirksamkeit und Sicherheit von Skipping Multi-Exon zum Testen. In der aktuellen Studie, ein Cocktail von Antisense-Morpholinos Targeting Exon 6 und Exon 8 wurde entwickelt, und es restauriert Dystrophin-Expression in Körper-weiten Skelettmuskulatur. Verfahren zur Transfektion / Injektion von Cocktail-Oligos und Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit von Multi-Exon-Skipping im CXMD Hundemodell vorgestellt.
Duchenne – Muskeldystrophie (DMD) ist eine X-chromosomal – rezessiv Muskelerkrankung , die durch progressive Muskelschwäche gekennzeichnet, beschrieben zuerst von Dr. Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1. DMD ist eine gemeinsame etwa 1 in 3500 Jungen beeinflussen genetische Erkrankung weltweit, mit rund 20.000 betroffenen Kinder pro Jahr geboren 2,3. Die motorische Entwicklung verzögert und Gangstörungen sind in der frühen Kindheit 4, gefolgt von Rollstuhlabhängigkeit bei etwa den frühen Teenager gesehen. Der Tod tritt in der Regel im Alter zwischen 20 und 30 aufgrund von Atemwegs- oder Herzversagen 5-8. Es gibt derzeit keine Heilung für DMD. Behandlung mit Glucocorticoiden kann das Fortschreiten der Muskeldegeneration zu einem gewissen Grad verlangsamen aber mit erheblichen Nebenwirkungen, wie Adipositas und Diabetes mellitus 2,7,8 assoziiert ist. DMD resultiert aus Mutationen im Dystrophin (DMD) -Gen, mit einem Verlust von funktionellen Dystrophin protei führendenn. DMD ist ein extrem großes Gen mit über 2 Millionen Basenpaaren und 79 Exons 9,10. Löschen, Blödsinn und Vervielfältigung Mutationen führen zu Out-of-frame-Mutationen sind die häufigste Ursache für die DMD-Phänotyp. Die Regionen der Exons 3 bis 9 und Exons 45-55 sind "Mutation Hotspots" bezeichnet , da die meisten Patienten Deletionsmutationen innerhalb dieser Abschnitte des Gens, was zu einer nichtfunktionellen Dystrophin in DMD – Patienten 3,9,11-16. Dystrophin Funktionen innerhalb des Dystrophin-Glykoprotein-Komplex (DGC), die eine wichtige Rolle bei der Muskelmembranstabilisierung aufweist. Die N- und C-Termini sind die wichtigsten Bereiche für die Funktion, während der zentrale Stab Domäne eine weniger wichtige Rolle spielt 3,9,17. Die Einhaltung eines milden Phänotyp im Zusammenhang mit Becker – Muskeldystrophie (BMD), die vor allem ergibt sich aus in-frame – Mutationen innerhalb des DMD – Gens, inspiriert die Anwendung von Exon zur Behandlung von DMD – Skipping. BMD-Patienten haben eine verkürzte, aber functional, Dystrophin – Protein , die beide Enden 3,6,18 hält. Exon – Skipping, in der Theorie kann das Leseraster wiederherstellen, was zu einer verkürzten , aber funktionelle Dystrophin – Proteine ähnlich denen in BMD 3,19 gesehen.
Mehrere Arten von Antisense-Oligonukleotide (AON) wurden in klinischen Studien, einschließlich 2'O- methyliert Phosphorothioate (2'OMePS) und Phosphordiamidat Morpholino-Oligomere (PMOs) getestet. Auslassen von Exons 51 und 53 diese AONs verwendet wurde geprüft und während Ergebnisse vielversprechend sind, hat Single-Exon – Skipping Anwendbarkeit begrenzt, da es mutationsspezifischen 3, 19, 20,21, 22-26. Fragen bleiben auch über die Stabilität der resultierenden verkürzten Dystrophin – Proteine produziert von Single-Exon 22,23 überspringen. Zusätzlich erfordern einige Patienten mehr als ein einziges Exon , um den Leserahmen 3 zur Wiederherstellung übersprungen werden. Während technisch schwieriger, ist Multi-Exon-Skipping eine Methode, dieAdresse konnte diese Probleme 3,19. Multi-Exon – Skipping hat in dystrophen Hunde- und menschlichen Zelllinien in vitro gezeigt , vorher. Zusätzlich studiert mdx52 Maus und Hunde – X-chromosomal – Muskeldystrophie (CXMD) Hundemodelle für in vivo verwendet wurden , 22, 24-27. Canine X-chromosomal – Muskeldystrophie Japan (CXMD J) Beagles hier verwendet wurden, da der Leserahmen von CXMD J kann durch Multi-Exon – Skipping des Exons 6 und 8, oder zusätzliche Exons (zB Exons 3 bis 9) wiederhergestellt werden (Abbildung 1). Beagle-basierte CXMD teilt die gleiche Mutation Muster wie die Golden Retriever – Muskeldystrophie (GRMD) Modell, aber Beagles sind kleiner und billiger zu halten aufgrund ihrer Körpergröße, wodurch ein nützliches Modell für DMD 28,29 bereitstellt. CXMD Hunde imitieren stärker den menschlichen DMD – Phänotyp als kleinere Tiermodellen, wie Nagetieren und sind zuverlässiger für die toxikologische Bewertung 3,22,30,31 </snach oben> (Abbildung 2). CXMD Hunde zeigen progressive Muskel Verfall, Gangstörungen und Herz-und Atemprobleme ähnlich wie bei DMD gesehen. Verglichen mit Einzel-Exon-Skipping, ist Multi-Exon-Skipping zu einem viel größeren Anteil der Patienten anwendbar. Unter den drei häufigsten Mutationstypen (Deletionen, Unsinn, und Doppelungen), 80 bis 98% der Patienten , Multi-Exon – Skipping werden könnte 14,32,33 behandelt durch, während 45% aller DMD – Patienten von speziell Skipping Exons profitieren könnten 45 – 55 3,19,22,34.
Mit der Entwicklung von modifizierten Morpholinos, die Effizienz der AON-Cocktails auf Exon-Skipping zu erleichtern hat sich verbessert. Arginin-reichen zellpenetrierendes Peptid-konjugierte PMOs (PPMOs) und vivo-Morpholinos (vPMOs) sind AON Chemien , die deutlich zellpenetrierendes Fähigkeit und Stabilität 3,35-38 verbessert haben. Sorge bereitet weiter langfristige AON Toxizität; jedoch erhebliche Fortschritteist gemacht worden. Chemische Modifikationen an Morpholinos stark Nebeneffekte zu verringern und präklinischen Studien haben keine signifikanten toxischen Wirkungen 3,22,39,40 berichtet. Eine verbleibende Herausforderung für Multi-Exon – Skipping ist der Strombedarf für jeden einzelnen AON für Toxizitäts allein getestet werden, als ein einziges Medikament, statt zusammen als ein Cocktail 3,19,22,41,42. In DMD Studien sowohl Einzel- als auch Multi-Exon-Beteiligung an das Herz gezielt Skipping, hat es wenig Verbesserung in der dystrophischen Herzgewebe gewesen. Die Wirksamkeit von Morpholinos im Herzen wird vermutet, gering zu sein wegen der schlechten zellpenetrierendes Fähigkeit. Peptid-konjugiertes PPMOs haben die Fähigkeit von AONs verbesserte Herzzellen eindringen, um die Menge an funktionellen Dystrophin – Protein im Herzen 3,19,38 gerettet erhöht.
Hier unsere AON Cocktail Ansatz wird ausführlich diskutiert, einschließlich der Gestaltung von AON – Sequenzen mit ESEfinder Software 43. Protocols für Hunde Experimente mit Skipping Multi-Exon werden ebenfalls beschrieben. CXMD J Beagles wurden für die Exons 6 und 8 Überspringen Experimente verwendet. Multi-Exon in dem CXMD Hundemodell Überspringen zeigt vielversprechende Ergebnisse, aber Herausforderungen bleiben, dass müssen überwunden werden, bevor sie klinisch anwendbar sind.
Exon-Skipping ist eine vielversprechende therapeutische Technik zur Behandlung von DMD. Sowohl in vitro und in vivo Versuche haben gezeigt , dass die Multi-Exon – Skipping führbar ist. Hier wird die Verwendung des CXMD Hundemodell diskutiert. Zunächst wurden AONs entwickelt , um die Rettungs ESE und ESEfinder Programme mit Dystrophin – Exons 6 bis Ziel – 8. Die 2'OMePS AON Chemie für CXMD Myoblasten Transfektion und Morpholin AON Rückgrat Chemie wurde für In – vivo – Experimente ausgewählt verwendet wurde. vPMOs sind effizienter als unmodifizierte PMOs aber aufgrund ihrer höheren Toxizität sind sie für die systemische Injektionen nicht geeignet. RNA-Extraktion, RT-PCR und cDNA-Sequenzierung wurden auf den CXMD Myoblasten durchgeführt. Hunde mit dem PMO Cocktail injiziert waren klinisch abgestufter keine Besserung der klinischen Symptome zu bewerten. Nachdem die Hunde artgerecht eingeschläfert wurden, wurden Muskelproben und für Kryo-Schnitte vorbereitet genommen. Die Halbwertszeit von Dystrophin-Protein, induziert durch AONs wird angenommen, dass etwa 1 zu sein – 2 Monaten. Junge erwachsene Hunde wurden in dieser Studie verwendet wurden, obwohl diese Versuche mit neugeborenen Hunden und älteren Hunden durchgeführt werden (> 5 Jahre). Vorbereitete Muskelabschnitte wurden verwendet , Histopathologie zu bewerten und Dystrophin – Protein Rettung durch Western Blotting und Immunhistochemie 48 beurteilen.
Es ist wichtig sicherzustellen, dass das Volumen der Lösung vor der PMO-Injektionen korrekt ist; haben so erhebliche Auswirkungen auf die Ergebnisse zu tun, andernfalls wird. Während intramuskuläre Injektionen wird ein ausreichender Druck erforderlich, um die Muskelfasern zu gelangen. Die Überwachung der Hundegesundheit und Inspektion der Operationsstelle sind wichtig für die Fehlerbehebung. Um die Tiergesundheit, wöchentliche Bluttests überwachen und mit einem Gewicht durchgeführt werden sollte. Nach Euthanasie der Tiere und Herstellung von Muskelproben, Empfindlichkeit ein kritischer Schritt für die Gewährleistung Dystrophin-Protein bei der Erkennung sowohl des Tris-Acetat-Gel und halbtrockenen Blotting-Verfahren zu verwenden,während der Western-Blot-Verfahren.
Wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt, behandelt Myoblasten mit Ex6A, Ex6B, Ex8A, und der Cocktail (mit Ex6A, Ex6B, Ex8A und Ex8B) im Rahmen DMD Produkte hergestellt. Da keine Ex8B Exon-übersprungenen Produkte produziert, wurde es nicht in den nachfolgenden in vivo Experimenten verwendet. cDNA-Sequenzierung ergab, dass die Exons 6 – 9-Skipping aufgetreten und Immunzytochemie mit DYS-2-Färbung zeigten Dystrophin-Expression in behandelten Proben wiederhergestellt. AON-behandelten Hunden zeigten eine signifikante Zunahme der Dystrophin-positive Fasern. Dies zeigt, dass die Exons 6 bis 8 wurden übersprungenen und ein verkürztes Protein wurde hergestellt. Die Menge an Dystrophin-positiven Fasern erhöht, wenn ein Cocktail von AONs verwendet wurde, und war zu AON Dosierung proportional. Immunoblots zeigten Dystrophin-Expression in systemischen morpholino-behandelten Hunden erhöht. Der Skelettmuskel hatte variable Mengen an Dystrophin-Fasern; jedoch morpholino-behandelten Herzgewebe zeigte wenigVerbesserung der Dystrophin-Expression. Da Dystrophin mit hohem Molekulargewicht (427 kDa) hat der Nachweis von geringen Mengen des Eiweißes kann schwierig sein. Für die besten Ergebnisse, Tris-Acetat-Gel und die halbtrockenen Transferverfahren verwendet wurden. HE-Färbung zeigte verbesserte Histopathologie in den Morpholino-behandelten Hunden. Zentral-nukleiert Fasern (CNF) sind ein Zeichen für ungesunde Muskel und Zyklen von Muskeldegeneration und Regeneration darstellen. Morpholino behandelten CXMD Hunde zeigten eine Abnahme des Anteils der CNFs im Vergleich zu nicht behandelten CXMD Hunden. Klinische Einstufung ergab eine Verbesserung der Symptome, wie erhöhte Geh- und Lauffähigkeit, in morpholino-behandelten Tiere. Die Härte der Muskeln wird angenommen , dass Muskelatrophie zu reflektieren, damit es in der Benotungsskala 59 aufgenommen wurde. Die Härte des Oberschenkels (Hinterschenkel) Muskeln bewertet wurde; jedoch ausgeschlossen wir Schädel Schneidermuskel Muskeln, weil sie Hypertrophie zeigen neigen eher als Atrophie in CXMD. Die behandelten Hunde zeigened niedrigere Einstufung Partituren und hatte eine bessere Zeit auf der 15 m Lauftest. Verbesserte Mal auf der 15 – m – Prüfung sind ein Anzeichen für eine verbesserte Muskelfunktion 40. Höhere Gesamt Einstufung Werte zeigen schlechte Gesundheit und eine erhöhte Muskelatrophie.
Während diese Ergebnisse vielversprechend sind, präsentiert Multi-Exon-Skipping noch viele Herausforderungen, die überwunden werden müssen, bevor die Technik klinische Anwendbarkeit hat. Herzgewebe zeigt noch verminderte Aufnahme von AONs, wahrscheinlich aufgrund der Differenz in der zellulären Handel zwischen Herz- und Skelettgewebe. Keine toxischen Wirkungen wurden bei Tieren unter den gegenwärtigen Dosierungsschemata beobachtet; jedoch muss mehr getan werden, die Langzeittoxizität zu bewerten, bevor die Verwendung von AON-Cocktails zu klinischen Studien bewegen kann. Es ist schwierig, die Genehmigung für AON Cocktail Drogen zu gewinnen, weil jede Regulierungsagentur AON-Sequenz als ein einzigartiges Medikament definieren. Dies bedeutet, dass jede Sequenz in einem Cocktail individuell müssten für Safet getestet werdeny, mehr Zeit und mehr Geld erfordern. Ein weiteres Hindernis für den Einsatz von Multi-Exon-Skippings in einer klinischen Umgebung ist eine große Menge an Zwischenproteinprodukte mit unbekannten Funktionen erzeugt. Diese Proteine können potenziell führen zu unvorhersehbaren Nebenwirkungen in Abhängigkeit von der einzelnen Mutation 22. Darüber hinaus sind die Mutation Muster innerhalb von aktuellen dystrophischen Hund Modelle begrenzt. Es gibt nur wenige natürlich vorkommende Mutationen, und nicht alle Mutationen sind nützlich zur Untersuchung von Multi-Exon-Skipping. Die dystrophischen Schweinemodell verspricht eine gute Alternative für die zukünftige DMD Exon – Skipping – Studien 33, 34 zu sein.
Die DMD Hund Modelle haben einige Vorteile gegenüber anderen DMD-Modelle. Als ein größeres Tiermodell, klinische Sortier- und MRT sind möglich, für eine detailliertere Analyse zu ermöglichen. Da Hunde große Tiere sind, sind sie auch geeignet für Toxikologiestudien und enger die menschliche Krankheit im Vergleich zu dem Maus-Modell darstellen. Hund modelle haben auch Sequenzen DMD – Gen , das ähnlicher zu 23 Menschen sind, 34, 45.
Obwohl technisch anspruchsvoll , das Multi-Exon – Skipping Ansatz letztlich profitieren könnten> 90% der DMD – Patienten 24. Dies macht es eine viel bessere Alternative zu Single-Exon-Skipping, als Single-Exon-Skipping nur für einen kleinen Teil der Patienten ist. Darüber hinaus wird Multi-Exon-Skipping ermöglichen es uns, die Löschmuster auszuwählen, die die Funktionalität der verkürzten Dystrophin-Proteine zu optimieren. Zum Beispiel das Löschen von DMD Exons 45 – 55 mit außergewöhnlich milde Symptome oder asymptomatischen Personen 14,19,60-63 verbunden ist. Die Multi-Exon – Skipping des Exons 45 bis 55 bereits in einem Mausmodell der DMD mit einem Exon 52 Deletion (mdx52) unter Verwendung systemische Injektionen von vPMOs 22,26 nachgewiesen. Die Verwendung von Cocktails vPMOs wurde auch in anderen Formen von Muskeldystrophie gezeigt worden, wie beispielswie Fukuyama kongenitale Muskeldystrophie (FCMD). FCMD durch Exon-Trapping verursacht, in denen aberrante mRNA Splicing durch Retrotransposon Insertion verursacht wird. vPMOs wurden 64 das Splicing – Muster in sowohl einem FCMD Mausmodell und in menschlichen Zelllinien zu retten gezeigt. Next-Generation AON Chemien höhere Wirksamkeit und eine geringere Toxizität aufweisen würde die effektive Umsetzung des Multi-Exon-Skipping-Ansatz in die klinische Anwendung zu erleichtern. Zusätzlich könnte Multi-Exon – Skipping potentiell auf andere genetische Erkrankungen angewendet werden, wie beispielsweise die dysferlinopathies 24, 65.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by The University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse’s Journey – The Foundation for Gene and Cell Therapy, and the Women and Children’s Health Research Institute (WCHRI).
2'OMePS Transfection of Dog Myoblasts | |||
3ml 6 welled plates | IWAKI | 5816-006 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.01 | |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | 200 U/mL |
Lipofectin | Invitrogen | 18292-011 | Total volume of 100 mL in opti-MEM media at a ratio of 2:1 for lipofectin. 10 mL lipofectin for 5 mg RNA. |
2’OMePS | Eurogentec | Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU), and Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC). | |
Horse Serum | Gibco | 16050-114 | 2% |
streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 200 ug/mL |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Insulin | |||
Morpholino transfection of dog myoblasts | |||
All material from MePS Transfection of Dog Myoblasts for culturing | |||
Antisense morpholinos | Gene-tools |
Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC |
|
Endo-Porter | Gene-tools | ||
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Invitrogen | 15596-018 | 1mL/plate |
RNA Extraction and Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) | |||
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Invitrogen | 15596-018 | 1mL/plate |
Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | 200 uL |
1.5 ml Tubes | Eppendorf | 22363204 | |
Centrifudge | Beckman-Coulter | ||
75% Ethanol | Sigma-Aldrich | 34852 | |
UV Spectrometer | |||
Forward primer in exon 5 | Invitrogen | CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA 1.5 mL 10 mM |
|
Reverse primer in exon 10 | Invitrogen | TGCTTCGGTCTCTGTCAATG 1.5 L 10 mM |
|
dNTPS | Clontech | 3040 | |
One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
Thermo-cycler | Scinco | ||
Complementary DNA (cDNA) Sequencing | |||
Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Centrifudge | |||
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337454 | |
Intramuscular injections or open muscle biopsy | |||
Surgical Tools | Scissors, Scapal, needle, surgical thread | ||
Vet Ointment | |||
Iodophors | webtextiles | 12190-71-5 | |
chlorohexidine | Peridex | 12134 | |
Surgical Drapes | |||
Srubs | |||
Facial Mask | |||
Surgical Gloves | |||
Head Covering | |||
Thiopental sodium | Mitsubishi Tanabe Pharma | 20 mg/kg | |
Isoflurane | Abbott laboratories | 05260-05 | 2-3% |
Antisense morpholinos | Gene-tools | Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT), Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC) Dilute to a final volume of 100 L in opti-MEM media. 120–200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline |
|
27G Needles | TERUMO | SG3-2325 | |
50 mL syringe | TERUMO | SG2-03L2225 | |
buprenorphine hydrochloride | |||
Tougne Depressor | |||
cephalexin | 15 to 30 mg/kg | ||
cefazolin | 15 to 30 mg/kg | ||
buprenorphine | 0.01 mg/kg | ||
buprenorphine hydrochloride | 0.02 mg/kg | ||
Systemic Injections | |||
Syringe infusion pump | Muromachi | ||
22G Indwelling needles | TERUMO | SG3-2225 | |
27G Needles | TERUMO | SG3-2325 | |
50 mL syringe | TERUMO | SG2-03L2225 | |
Saline | Ohtsuka-Pharmaceutical | 28372 | |
Clinical Grading of Dogs | |||
Video Camera | |||
Stop watch | |||
Magnetic resonance imaging (MRI) | |||
3 Tesla MRI l | |||
18 cm diameter/18 cm length human extremity coi | |||
Muscle sampling and preparation (necropsy) | |||
Thiopental sodium | Mitsubishi Tanabe Pharma | 20 mg/kg | |
Isoflurane | Abbott laboratories | 05260-05 | 2-3% |
Tragacanth gum | 10-20 mL | ||
Liqoud Nitrogrn | |||
Cork Discs | Iwai-kagaku | 101412-806 | |
Dry Ice | |||
Tweezers | |||
Poly-l-lysine–coated slides | Fisher | 22-037-216 | |
Cryostat Microsystem | Leica | cm1900 | |
Immunohistochemistry | |||
DYS1 | Novocastra | NCL-DYS1 | 1:150 dilutions |
DYS2 | Novocastra | NCL-DYS2 | 1:150 dilutions |
Alexa 594 goat antimouse IgG1 | Invitrogen | A-21125 | 1:2,500 dilutions |
Alexa 594 goat antimouse IgG2 | Invitrogen | A-11005 | 1:2,500 dilutions |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Contans mounting agent |
Goat Serum | Invitrogen | 10000C | 15% |
PBS | |||
Moisture chamber | Scientific Devise Laboratory | 197-BL | |
Chamber slide | Lab-tek | 154453 | |
Cover Glasses | Fisher | 12-540A | |
Hydrophobic barrier pen | |||
Flpurescent microcope | 594 nm at 20X magnification. | ||
Western Blotting | |||
Distillied Water | |||
Hand Homogenizer | |||
2× Laemmli SDS-loading buffer | 0.1 M Tris–HCl (pH 6.6), 2% (w/v) SDS, 2% (0.28 M) beta-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue | ||
SDS gels | Bio-Rad | 161-1210 | 5% resolving |
SDS gels | Invitrogen | Invitrogen, WG1601BOX | 3-8% |
PVDF membrane | GE | 10600021 | |
Methanol | |||
Transfer buffer (10×) | 250 mM of Tris-Base, 1,920 mM of Glycine | ||
Transfer buffer (1×) | 10% 10× buffer, 20% methanol | ||
0.05% PBS/Tween 20 (PBST) | 2,000 mL 3× 200 mL for washing |
||
PBST/5% milk powder | 100 mL | ||
Protein Assay Kit | BCA | T9650 | |
Tween 20 | Sigma | P5927 | |
Urea | Sigma | U5378 | |
Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
SDS | Sigma | L3771 | |
Tris-Acetate | Sigma | ||
Tris HCL | Sigma | T3253 | |
Glycerol | Sigma | G8773 | |
Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
NaCl | Sigma | S3014 | |
PMSF | Sigma | P7626 | |
Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
Cathode Buffer | .025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20 % Methanol | ||
desmin antibody | Abcam | ab8592 | |
DYS1 | Novocastra | NCL-DYS1 | 1:150 dilutions |
Image J Software |