심 외막 파생물 문화 분석 및<em> 전의 VIVO</em> 심 외막 유래 세포 마이그레이션 평가
Özet
Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.
Abstract
심 외막 세포 선 단층 심장, 심근 세포의 증식을 자극 분비 인자를 제공하고 직접 개발 및 심혈관 질환 중에 조상 기여. 다수의 인자가 심장 외막 유래 세포 (EPDC) 동원에 연루되어 있지만, 그 이후의 이동과 분화를 지배하는 메커니즘이 제대로 이해된다. 여기, 우리는 EPDC 운동성 및 분화를 연구하는 생체 외 및 생체 전략을 제시한다. 먼저, 마우스 배아 심장에서 생장 배양 주 외막 세포를 얻는 방법을 설명한다. 또한 장기 배양 시스템에서 표지 EPDC 입체 마이그레이션을 평가하기 상세한 프로토콜을 소개한다. 우리는 심장 외막에 myocardin 관련 전사 인자의 유전 삭제 EPDC 마이그레이션을 감쇠 이러한 기술을 사용하여 증거를 제공합니다. 이 방법은 EPDC의 후보 수식을 평가하기위한 플랫폼 역할생물학은 심장 수리를 위해 유용 할 수 있습니다 EPDC 동원의 새로운 규제를 식별하는 유전 물질 또는 화학 물질 화면을 개발하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
심장 외막은 중피 세포의 단일 층입니다 라인 심장과 영향 심장 개발, 성숙 및 수리. 분비 신호 높은 코디 교환을 통해, 심근과 외막 사이에 친밀한 대화 심장 성장 및 비 – 심장 근세포 계통 (1)의 형성에 필수적이다. 심 외막 유래 세포 (EPDC)의 상피 – 투 – 중간 엽 전이 (EMT) (2)를 통해 심 외막 세포의 일부에서 등장는 subepicardial 공간 및 기본 심근 침입, 크게 관상 동맥 혈관 벽화 세포와 심장 섬유 아 세포로 분화하고,에 조금 적게, 내피 세포 및 심근 3-9.
심 외막 EMT 및 EPDC 침입 조절 메커니즘 분비 리간드 10-13, 세포 표면 수용체 및 부착 분자 (14, 15), 가열 공기 조절기 등 다양한 분자의 조정 동작에 기인 한혀끝 – 기초 극성 16, 17, 작은 GTP 아제 18, 19, 및 전사의 lators은 2,20,21 요인. EPDC 이주의 분자 이펙터 많은 정의되었지만, 전략의 개발을 촉진 할 수있다 배아 EPDC 가동화를 자극하는 생리적 신호의 더 나은 이해를 개선 심장 수리 어른이 공정을 조작한다.
EPDC 동원의 새로운 규제를 식별하기위한 연구는이 세포 인구의 정제 또는 개별 심 외막 세포의 이동을 추적에 의존하고 있습니다. 하나 WT1, Tcf21, Tbx18 및 / 또는 Aldh1a2 포함 마커 유전자의 조합은 일반적으로 태아의 심장 외막 하나를 식별하는 데 사용된다. 그러나, 이들 마커의 사용은 심 외막 세포 transdif을 겪을 때 심 외막 마커의 발현은 심장 개발의 과정 기울면 종종 손실로 EPDC 최적 아니다 마이그레이션 추적중간 엽 세포로 ferentiation.
정속 신장식 /에 loxP 시스템의 응용 프로그램은, 혈통-추적 기자와 함께 영구적으로 심장 개발하는 동안 심장 외막와 그 하위 라벨 및 성인 7,22,23에서 허혈 손상을 다음에 유용합니다. 여러 심 외막 제한 Cre 호텔 라인이 생성되어 널리 EPDC 라벨 및 조건부 유전자 삭제 전략 1하는 데 사용됩니다. 이러한 연구는 다양한 심 외막 계통의 특성 및 EPDC 운동성 및 분화의 중요한 매개체의 식별을 주도했다. 그러나, 축적 증거가 심장 외막이 전구 세포 4,24,25의 이기종 인구 제안합니다. 따라서, 심 외막 세포의 서브 세트 만이 주어진 Cre 호텔 드라이버를 사용하여 타겟팅된다.
에 관계없이 Cre 호텔 특이성의 전체 심장 외막에 레이블을하기 위해, 실험실의 수는 가지 막힌를 활용 한진짜야 시스템 또는 생체 기관 배양 방법은 충실하게 격리 또는 26 ~ 28 마커 유전자 혈통의 표현에 의존하지 않고 심 외막 세포를 레이블을. 생체 마이그레이션 연구의 경우, 배아 마음 심 외막 EMT 이전 및 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현 아데노 바이러스 (광고 / GFP) 9,18 보충 된 배지에서 배양 격리됩니다. 이 접근법은 효율적인 전체 심장 외막의 표시보다는 Cre 호텔 매개 재조합에 의해 세포의 부분 집합을 허용한다. 심장의 문화는 이후 EPDC (28, 29)의 동원을 자극하는 EMT의 알려진 유도 물질에 노출되어있다. 예 생체 내 및 생체 내 분석 EPDC 마이그레이션을 운전 자세한 메커니즘을 탐구에 특히 유용한 방법이다 체외 심 외막 이식편 문화에 의해 보완된다.
여기, 우리는 epicardi의 체외 연구에 대한 기본 심 외막 세포를 분리하는 방법을 설명합니다알 EMT뿐만 아니라 생체에 대한 기관 배양 물 시스템은 EPDC 운동성 분석. 우리는 최근 유전자 EPDC 9 굴지 기반 마이그레이션을 조작하는 축 시그널링 myocardin 관련 전사 인자 (MRTF) / 혈청 반응 계수 (SRF)를 변조하여이 방법의 유용성과 견고성을 증명하고있다. 우리의 연구 결과는 EPDC 이동을 규제하기 위해 필요한 하나의 신호 전달 경로를 강조하지만,이 방법은 집합 EPDC 마이그레이션 및 차별화를 조율 메커니즘을 해명하기에 적합하다. 또한, 체외 이식편 및 생체 외 배양 시스템은 심장 재생 치료에 응용 프로그램 EPDC 동원 신규 레귤레이터를 식별하는 기능 화면에서 구현 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 가지가 기본 심 외막 세포를 분리하고 생체 심장 문화 EPDC 이동을 추적하는 자세한 방법을 설명합니다. 가지 문화를 들면, 심장 외막 고갈 마음을 제거 할 수있는 적절한 시간 실험 사이에 약간 다릅니다. 하룻밤 배양 후 외식의주기적인 모니터링이 심 외막 가지의 정도를 측정하고 섬유 아세포를 표시하기 전에 마음을 추출하는 것이 좋습니다. 순도를 보장하기 위해, 마음…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EMS는 건강 (NIH)의 국립 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다 [부여 번호 R01HL120919] 미국 심장 협회 [허가 번호 10SDG4350046] 국립 보건원 [허가 번호 UL1 TR000042]에서 로체스터 CTSA 수상의 대학; 그리고 AAB CVRI에서 시작 기금. MAT는 하워드 휴즈 의학 연구소 메드 – 속 – 대학원 이니셔티브에서 의학 및 치과 로체스터 대학의 대학에 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다; 그리고 NIH [허가 번호 GM068411]에서 기관 루스 L. Kirschstein 국가 연구 서비스 상.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH3002201 | DMEM |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Hyclone | SH3003102 | HBSS |
| Medium 199 | Hyclone | SH3025301 | M199 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Hyclone | SH3002802 | DPBS |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | FBS |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Hyclone | SV30010 | |
| Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides | Corning | 354557 | |
| Multiwell 24-well plates | Falcon | 08-772-1 | |
| Dissecting microscope | Leica | M50 | Equipped with Leica KL300 LED might source |
| Confocal miscroscope | Olympus | 1X81 | Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Transforming growth factor beta 1 | R&D Systems | 100-B-001 | TGF-β1 |
| Platelet-derived growth factor BB | R&D Systems | 220-BB-010 | PDGF-BB |
| Trizol Reagent | Applied Biosystems | 15596-026 | Caution, hazardous material |
| TURBO DNA-free Kit | Life Technologies | AM1907 | DNaseI |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891 | |
| UltraPure Glycogen | Life Technologies | 10814-010 | |
| SYBR Green | BioRad | 170-8880 | |
| Protease inhibtor cocktail tablets | Roche | 11836170001 | |
| Alexa Goat-anti-rabbit 488 | Life Technologies | A11008 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-rabbit 594 | Life Technologies | A-11012 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-mouse 594 | Life Technologies | A-11005 | Secondary antibody |
| Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated | Sigma-Aldrich | C6198 | monoclonal antibody, clone 1A4 |
| Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) | Life Technologies | MA1-46028 | monoclonal antibody, clone 6F-H2 |
| Rabbit anti-ZO1 | Life Technologies | 40-2200 | polyclonal antibody |
| Rabbit anti-Collagen Type 4 | Millipore | AB756P | polyclonal antibody |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Life Technologies | D1306 | DAPI |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | |
| 16% Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences | TFM-B | |
| Pap pen | DAKO | S2002 | |
| Disposable mictrotome blades | Sakura Finetek | 4689 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1358W | positively charged, 25 x 75 x 1mm |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Disposable base molds | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| Ketamine | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
Referanslar
- von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
- Martinez-Estrada, O. M., et al. Wt1 is required for cardiovascular progenitor cell formation through transcriptional control of Snail and E-cadherin. Nat Genet. 42, 89-93 (2010).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
- Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
- Wilm, B., Ipenberg, A., Hastie, N. D., Burch, J. B., Bader, D. M. The serosal mesothelium is a major source of smooth muscle cells of the gut vasculature. Development. 132, 5317-5328 (2005).
- Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454, 109-113 (2008).
- Dettman, R. W., Denetclaw, W., Ordahl, C. P., Bristow, J. Common epicardial origin of coronary vascular smooth muscle, perivascular fibroblasts, and intermyocardial fibroblasts in the avian heart. Dev Biol. 193, 169-181 (1998).
- Trembley, M. A., Velasquez, L. S., de Mesy Bentley, K. L., Small, E. M. Myocardin-related transcription factors control the motility of epicardium-derived cells and the maturation of coronary vessels. Development. 142, 21-30 (2015).
- Mellgren, A. M., et al. Platelet-derived growth factor receptor beta signaling is required for efficient epicardial cell migration and development of two distinct coronary vascular smooth muscle cell populations. Circ Res. 103, 1393-1401 (2008).
- von Gise, A., et al. WT1 regulates epicardial epithelial to mesenchymal transition through beta-catenin and retinoic acid signaling pathways. Dev Biol. 356, 421-431 (2011).
- Lavine, K. J., et al. Endocardial and Epicardial Derived FGF Signals Regulate Myocardial Proliferation and Differentiation In Vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
- Sanchez, N. S., Barnett, J. V. TGFbeta and BMP-2 regulate epicardial cell invasion via TGFbetaR3 activation of the Par6/Smurf1/RhoA pathway. Cell Signal. 24, 539-548 (2012).
- Dettman, R. W., Pae, S. H., Morabito, C., Bristow, J. Inhibition of 4-integrin stimulates epicardial-mesenchymal transformation and alters migration and cell fate of epicardially derived mesenchyme. Dev Biol. 257, 315-328 (2003).
- Rhee, D. Y., et al. Connexin 43 regulates epicardial cell polarity and migration in coronary vascular development. Development. 136, 3185-3193 (2009).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Hirose, T., et al. PAR3 is essential for cyst-mediated epicardial development by establishing apical cortical domains. Development. 133, 1389-1398 (2006).
- Baek, S. T., Tallquist, M. D. Nf1 limits epicardial derivative expansion by regulating epithelial to mesenchymal transition and proliferation. Development. 139, 2040-2049 (2012).
- Lu, J., et al. Coronary smooth muscle differentiation from proepicardial cells requires rhoA-mediated actin reorganization and p160 rho-kinase activity. Dev Biol. 240, 404-418 (2001).
- Combs, M. D., Braitsch, C. M., Lange, A. W., James, J. F., Yutzey, K. E. NFATC1 promotes epicardium-derived cell invasion into myocardium. Development. 138, 1747-1757 (2011).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139, 2139-2149 (2012).
- Zhou, B., von Gise, A., Ma, Q., Hu, Y. W., Pu, W. T. Genetic fate mapping demonstrates contribution of epicardium-derived cells to the annulus fibrosis of the mammalian heart. Dev Biol. 338, 251-261 (2010).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
- Singh, M., Epstein, J. Epicardial Lineages and Cardiac Repair. Journal of Developmental Biology. 1, 141-158 (2013).
- Braitsch, C. M., Combs, M. D., Quaggin, S. E., Yutzey, K. E. Pod1/Tcf21 is regulated by retinoic acid signaling and inhibits differentiation of epicardium-derived cells into smooth muscle in the developing heart. Dev Biol. 368, 345-357 (2012).
- Austin, A. F., Compton, L. A., Love, J. D., Brown, C. B., Barnett, J. V. Primary and immortalized mouse epicardial cells undergo differentiation in response to TGFbeta. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 366-376 (2008).
- Kim, J., Rubin, N., Huang, Y., Tuan, T. L., Lien, C. L. In vitro culture of epicardial cells from adult zebrafish heart on a fibrin matrix. Nat Protoc. 7, 247-255 (2012).
- Compton, L. A., Potash, D. A., Mundell, N. A., Barnett, J. V. Transforming growth factor-beta induces loss of epithelial character and smooth muscle cell differentiation in epicardial cells. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 82-93 (2006).
- Smith, C. L., Baek, S. T., Sung, C. Y., Tallquist, M. D. Epicardial-derived cell epithelial-to-mesenchymal transition and fate specification require PDGF receptor signaling. Circ Res. 108, 15-26 (2011).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. JOVE. 2, (2007).
- Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 32, 1026-1035 (2014).
- Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
- Takeichi, M., Nimura, K., Mori, M., Nakagami, H., Kaneda, Y. The transcription factors Tbx18 and Wt1 control the epicardial epithelial-mesenchymal transition through bi-directional regulation of Slug in murine primary epicardial cells. PloS one. 8, e57829 (2013).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 39, 75-85 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Moore, A. W., McInnes, L., Kreidberg, J., Hastie, N. D., Schedl, A. YAC complementation shows a requirement for Wt1 in the development of epicardium, adrenal gland and throughout nephrogenesis. Development. 126, 1845-1857 (1999).
- Kim, J., et al. PDGF signaling is required for epicardial function and blood vessel formation in regenerating zebrafish hearts. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17206-17210 (2010).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, 1420-1428 (2009).
- Dong, X. R., Maguire, C. T., Wu, S. P., Majesky, M. W. Chapter 9 Development of Coronary Vessels. Methods in Enzymology. 445, 209-228 (2008).
- Ruiz-Villalba, A., Ziogas, A., Ehrbar, M., Perez-Pomares, J. M. Characterization of epicardial-derived cardiac interstitial cells: differentiation and mobilization of heart fibroblast progenitors. PLoS One. 8, e53694 (2013).
- Garriock, R. J., Mikawa, T., Yamaguchi, T. P. Isolation and culture of mouse proepicardium using serum-free conditions. Methods. 66, 365-369 (2014).
- Smart, N., Riley, P. Derivation of epicardium-derived progenitor cells (EPDCs) from adult epicardium. Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2009).
- Zhou, B., Pu, W. T. Isolation and characterization of embryonic and adult epicardium and epicardium-derived cells. Methods Mol Biol. 843, 155-168 (2012).
- Morabito, C. J., Dettman, R. W., Kattan, J., Collier, J. M., Bristow, J. Positive and negative regulation of epicardial-mesenchymal transformation during avian heart development. Dev Biol. 234, 204-215 (2001).
- Grieskamp, T., Rudat, C., Ludtke, T. H., Norden, J., Kispert, A. Notch signaling regulates smooth muscle differentiation of epicardium-derived cells. Circ Res. 108, 813-823 (2011).
