Özet

심 외막 파생물 문화 분석 및<em> 전의 VIVO</em> 심 외막 유래 세포 마이그레이션 평가

Published: March 18, 2016
doi:

Özet

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Abstract

심 외막 세포 선 단층 심장, 심근 세포의 증식을 자극 분비 인자를 제공하고 직접 개발 및 심혈관 질환 중에 조상 기여. 다수의 인자가 심장 외막 유래 세포 (EPDC) 동원에 연루되어 있지만, 그 이후의 이동과 분화를 지배하는 메커니즘이 제대로 이해된다. 여기, 우리는 EPDC 운동성 및 분화를 연구하는 생체 외생체 전략을 제시한다. 먼저, 마우스 배아 심장에서 생장 배양 주 외막 세포를 얻는 방법을 설명한다. 또한 장기 배양 시스템에서 표지 EPDC 입체 마이그레이션을 평가하기 상세한 프로토콜을 소개한다. 우리는 심장 외막에 myocardin 관련 전사 인자의 유전 삭제 EPDC 마이그레이션을 감쇠 이러한 기술을 사용하여 증거를 제공합니다. 이 방법은 EPDC의 후보 수식을 평가하기위한 플랫폼 역할생물학은 심장 수리를 위해 유용 할 수 있습니다 EPDC 동원의 새로운 규제를 식별하는 유전 물질 또는 화학 물질 화면을 개발하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

심장 외막은 중피 세포의 단일 층입니다 라인 심장과 영향 심장 개발, 성숙 및 수리. 분비 신호 높은 코디 교환을 통해, 심근과 외막 사이에 친밀한 대화 심장 성장 및 비 – 심장 근세포 계통 (1)의 형성에 필수적이다. 심 외막 유래 세포 (EPDC)의 상피 – 투 – 중간 엽 전이 (EMT) (2)를 통해 심 외막 세포의 일부에서 등장는 subepicardial 공간 및 기본 심근 침입, 크게 관상 동맥 혈관 벽화 세포와 심장 섬유 아 세포로 분화하고,에 조금 적게, 내피 세포 및 심근 3-9.

심 외막 EMT 및 EPDC 침입 조절 메커니즘 분비 리간드 10-13, 세포 표면 수용체 및 부착 분자 (14, 15), 가열 공기 조절기 등 다양한 분자의 조정 동작에 기인 한혀끝 – 기초 극성 16, 17, 작은 GTP 아제 18, 19, 및 전사의 lators은 2,20,21 요인. EPDC 이주의 분자 이펙터 많은 정의되었지만, 전략의 개발을 촉진 할 수있다 배아 EPDC 가동화를 자극하는 생리적 신호의 더 나은 이해를 개선 심장 수리 어른이 공정을 조작한다.

EPDC 동원의 새로운 규제를 식별하기위한 연구는이 세포 인구의 정제 또는 개별 심 외막 세포의 이동을 추적에 의존하고 있습니다. 하나 WT1, Tcf21, Tbx18 및 / 또는 Aldh1a2 포함 마커 유전자의 조합은 일반적으로 태아의 심장 외막 하나를 식별하는 데 사용된다. 그러나, 이들 마커의 사용은 심 외막 세포 transdif을 겪을 때 심 외막 마커의 발현은 심장 개발의 과정 기울면 종종 손실로 EPDC 최적 아니다 마이그레이션 추적중간 엽 세포로 ferentiation.

정속 신장식 /에 loxP 시스템의 응용 프로그램은, 혈통-추적 기자와 함께 영구적으로 심장 개발하는 동안 심장 외막와 그 하위 라벨 및 성인 7,22,23에서 허혈 손상을 다음에 유용합니다. 여러 심 외막 제한 Cre 호텔 라인이 생성되어 널리 EPDC 라벨 및 조건부 유전자 삭제 전략 1하는 데 사용됩니다. 이러한 연구는 다양한 심 외막 계통의 특성 및 EPDC 운동성 및 분화의 중요한 매개체의 식별을 주도했다. 그러나, 축적 증거가 심장 외막이 전구 세포 4,24,25의 이기종 인구 제안합니다. 따라서, 심 외막 세포의 서브 세트 만이 주어진 Cre 호텔 드라이버를 사용하여 타겟팅된다.

에 관계없이 Cre 호텔 특이성의 전체 심장 외막에 레이블을하기 위해, 실험실의 수는 가지 막힌를 활용 한진짜야 시스템 또는 생체 기관 배양 방법은 충실하게 격리 또는 26 ~ 28 마커 유전자 혈통의 표현에 의존하지 않고 심 외막 세포를 레이블을. 생체 마이그레이션 연구의 경우, 배아 마음 심 외막 EMT 이전 및 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현 아데노 바이러스 (광고 / GFP) 9,18 보충 된 배지에서 배양 격리됩니다. 이 접근법은 효​​율적인 전체 심장 외막의 표시보다는 Cre 호텔 매개 재조합에 의해 세포의 부분 집합을 허용한다. 심장의 문화는 이후 EPDC (28, 29)의 동원을 자극하는 EMT의 알려진 유도 물질에 노출되어있다. 예 생체 내생체 내 분석 EPDC 마이그레이션을 운전 자세한 메커니즘을 탐구에 특히 유용한 방법이다 체외 심 외막 이식편 문화에 의해 보완된다.

여기, 우리는 epicardi의 체외 연구에 대한 기본 심 외막 세포를 분리하는 방법을 설명합니다알 EMT뿐만 아니라 생체에 대한 기관 배양 물 시스템은 EPDC 운동성 분석. 우리는 최근 유전자 EPDC 9 굴지 기반 마이그레이션을 조작하는 축 시그널링 myocardin 관련 전사 인자 (MRTF) / 혈청 반응 계수 (SRF)를 변조하여이 방법의 유용성과 견고성을 증명하고있다. 우리의 연구 결과는 EPDC 이동을 규제하기 위해 필요한 하나의 신호 전달 경로를 강조하지만,이 방법은 집합 EPDC 마이그레이션 및 차별화를 조율 메커니즘을 해명하기에 적합하다. 또한, 체외 이식편 및 생체 외 배양 시스템은 심장 재생 치료에 응용 프로그램 EPDC 동원 신규 ​​레귤레이터를 식별하는 기능 화면에서 구현 될 수있다.

Protocol

참고 : 마우스 모든 실험은 로체스터 대학 동물 자원에 대학위원회에 의해 승인되었다. 1 심 외막 파생물 문화 분석 (그림 1A) 준비 5 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PEN / 패 혈성) 중간 (199) (M199)를 보충하여 주 외막 세포 격리 5 ml의 배지 A를 준비한다. 매체 사전 따뜻한 100ml를 37 ° C의 물을 욕조에 행크스 '균형 소금 솔루션 (HBSS). 콜라겐 – …

Representative Results

심장 외막이 효율적으로 외부 위치를 활용하고 개발 소성 및 EPDC의 고유 철새 동작을 이용하여 부산물 문화 분석을 이용하여 분리 할 수​​ 있습니다. 쥐의 배아 마음 전에 아래 콜라겐 코팅 챔버 슬라이드에 심 외막 EMT 배양 등의 측에 E11.5에서 분리되어 26 (그림 1A, B). 외식 마음은 계약을 계속; 그러나, 심장 외막은 콜라겐 매트릭스 준수와 문화의 24…

Discussion

여기에서 우리는 가지가 기본 심 외막 세포를 분리하고 생체 심장 문화 EPDC 이동을 추적하는 자세한 방법을 설명합니다. 가지 문화를 들면, 심장 외막 고갈 마음을 제거 할 수있는 적절한 시간 실험 사이에 약간 다릅니다. 하룻밤 배양 후 외식의주기적인 모니터링이 심 외막 가지의 정도를 측정하고 섬유 아세포를 표시하기 전에 마음을 추출하는 것이 좋습니다. 순도를 보장하기 위해, 마음…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

EMS는 건강 (NIH)의 국립 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다 [부여 번호 R01HL120919] 미국 심장 협회 [허가 번호 10SDG4350046] 국립 보건원 [허가 번호 UL1 TR000042]에서 로체스터 CTSA 수상의 대학; 그리고 AAB CVRI에서 시작 기금. MAT는 하워드 휴즈 의학 연구소 메드 – 속 – 대학원 이니셔티브에서 의학 및 치과 로체스터 대학의 대학에 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다; 그리고 NIH [허가 번호 GM068411]에서 기관 루스 L. Kirschstein 국가 연구 서비스 상.

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium Hyclone  SH3002201 DMEM
Hanks' Balanced Salt Solution Hyclone SH3003102 HBSS
Medium 199 Hyclone SH3025301 M199
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline  Hyclone SH3002802 DPBS
Fetal Bovine Serum  Gemini  100-106 FBS
Penicillin/Streptomycin Solution Hyclone SV30010
Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides Corning 354557
Multiwell 24-well plates Falcon 08-772-1
Dissecting microscope Leica M50 Equipped with Leica KL300 LED might source
Confocal miscroscope Olympus 1X81 Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp
Bioruptor Diagenode  UCD-200
Transforming growth factor beta 1 R&D Systems 100-B-001 TGF-β1
Platelet-derived growth factor BB R&D Systems 220-BB-010 PDGF-BB
Trizol Reagent Applied Biosystems 15596-026 Caution, hazardous material
TURBO DNA-free Kit Life Technologies AM1907 DNaseI
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 1708891
UltraPure Glycogen Life Technologies 10814-010
SYBR Green BioRad 170-8880
Protease inhibtor cocktail tablets Roche 11836170001
Alexa Goat-anti-rabbit 488 Life Technologies A11008 Secondary antibody
Alexa Goat anti-rabbit 594 Life Technologies A-11012 Secondary antibody
Alexa Goat anti-mouse 594 Life Technologies A-11005 Secondary antibody
Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated  Sigma-Aldrich C6198 monoclonal antibody, clone 1A4
Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) Life Technologies MA1-46028 monoclonal antibody, clone 6F-H2
Rabbit anti-ZO1 Life Technologies 40-2200 polyclonal antibody
Rabbit anti-Collagen Type 4 Millipore AB756P polyclonal antibody
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride  Life Technologies D1306 DAPI
Fluorescent mounting medium  DAKO S3023
16% Paraformaldehyde solution Electron Microscopy Sciences 15710 PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Tissue Freezing Medium Triangle Biomedical Sciences TFM-B
Pap pen DAKO S2002
Disposable mictrotome blades  Sakura Finetek 4689
Microscope slides Globe Scientific 1358W positively charged, 25 x 75 x 1mm
Cryostat  Leica CM1950
Forceps Fine Science Tools 11295-00
Surgical Scissors Fine Science Tools 91460-11
Disposable base molds Fisher Scientific 22-363-553
Ketamine Hospira NDC 0409-2051-05
Xylazine Akorn NADA 139-236

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
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