Epikardiale Outgrowth Kulturtest und<em> Ex Vivo</em> Beurteilung von Epikardiale abgeleiteten Zellmigration

Das Epikard ist eine einzelne Schicht aus Mesothelzellen, die Linien das Herz und die Auswirkungen Herz Entwicklung, Reifung und Reparatur. Durch eine hoch koordinierten Austausch von parakrine Signale ist die innige Dialog zwischen dem Myokard und Epikard unverzichtbar für kardiale Wachstum und der Bildung von Nicht-Myozyten – Herzabstammungslinien ^1. Epikardiale abgeleiteten Zellen (EPDC) ergeben sich aus einer Untergruppe von epikardialen Zellen durch eine epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT) ^2, dringen in den subepikardialen Raum und das darunter liegende Myokard und unterscheiden weitgehend in koronaren Gefäßwandzellen und kardialen Fibroblasten, und ein geringerem Maße, Endothelzellen und Kardiomyozyten ^3-9.

Die Regulierungsmechanismen epikardialen EMT und EPDC Invasion haben die koordinierte Aktion verschiedener Moleküle einschließlich sezerniert Liganden ^10-13, Zelloberflächenrezeptoren und Adhäsionsmoleküle ^14,15, regel zugeschrieben wordenToren der apikal-basale Polarität ^16,17, kleine GTPasen ^18,19 und Transkriptionsfaktoren ^2,20,21. Während viele der molekularen Effektoren der EPDC Migration definiert wurden, ein besseres Verständnis der physiologischen Signale, die EPDC Mobilisierung im Embryo stimulieren kann die Entwicklung von Strategien beschleunigen diesen Prozess bei Erwachsenen für eine verbesserte Herz-Reparatur zu manipulieren.

Ziel Studien neue Regulatoren der EPDC Mobilisierung zu identifizieren, verlassen sich auf die Reinigung von dieser Zellpopulation oder die Migration einzelner epikardialen Zellen zu verfolgen. Eine oder eine Kombination von Markergenen, einschließlich Wt1, Tcf21, Tbx18 und / oder Aldh1a2, wird üblicherweise um die fötale Epikard ¹ zu identifizieren. die Verwendung dieser Marker jedoch zu verfolgen EPDC Migration nicht optimal ist, als Ausdruck der epikardialen Markierungen im Laufe der Herzentwicklung nachlässt und wird oft verloren, wenn epikardialen Zellen transdif laufenferenzierung in mesenchymalen Zellen.

Die Anwendung des Cre / loxP – System in Verbindung mit lineage-Tracing – Reporter wurde in permanent Markierung des Epikard und seine Abkömmlinge während Herzentwicklung und nach ischämischer Verletzung im erwachsenen ^7,22,23 nützlich. Mehrere epikardialen beschränkten Cre Linien wurden ¹ erzeugt und verwendet werden , weit EPDC und für die bedingte Gen – Deletion Strategien zu beschriften. Diese Studien haben die Charakterisierung verschiedener Abstammungen epikardialen geführt, und die Identifizierung von kritischen Mediatoren von EPDC Motilität und Differenzierung. Allerdings akkumulieren Hinweise darauf , auch die Epikard eine heterogene Population von Vorläuferzellen ^4,24,25 ist. Somit wird nur eine Teilmenge von epikardialen Zellen gerichtet werden, um einen gegebenen Cre-Treiber.

Um die gesamte Epikard unabhängig von Cre Spezifität, eine Reihe von Labors zu beschriften haben Auswuchs cul genutztture Systeme oder ex – vivo – Verfahren der Organkultur zu epikardialen Zellen treu zu isolieren oder zu beschriften , ohne in Abhängigkeit von der Expression eines genetischen Abstammungslinie Marker ^26-28. Für die Ex – vivo – Migrationsstudien, sind embryonale Herzen vor dem epikardialen EMT und in Medium mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP) exprimierenden Adenovirus (Ad / GFP) ^9,18 ergänzt isoliert. Dieser Ansatz ermöglicht eine effiziente Markierung des gesamten Epikard eher als eine Untergruppe von Zellen, die durch Cre-vermittelte Rekombination. Herz – Kulturen werden anschließend mit bekannten Induktoren von EMT ausgesetzt , um die Mobilisierung von EPDC ^28,29 zu stimulieren. Ex – vivo und videodan – vivo – Analysen werden ergänzt durch in vitro epikardialen Explantation Kulturen, die sind ein besonders nützlicher Ansatz für die Erkundung detaillierten Mechanismen der Fahrt EPDC Migration.

Hier beschreiben wir Verfahren zur Isolierung von primären epikardialen Zellen für in vitro – Studien von epicardial EMT sowie ein Organkultursystem für die ex vivo – Analysen von EPDC Motilität. Wir haben vor kurzem gezeigt , den Nutzen und die Robustheit dieser Methode durch genetisch die myocardin-related transcription factor Modulation (MRTF) / Serum Response Factor (SRF) Signalisierungsachse ⁹ Aktin-basierte Migration von EPDC zu manipulieren. Während unsere Ergebnisse notwendig für die Regulierung EPDC Migration eines Signalwegs zu markieren, sind diese Verfahren geeignet ist, die Mechanismen zu entwirren, die gemeinsam EPDC Migration und Differenzierung zu orchestrieren. Darüber hinaus könnte das Explantat und ex vivo – Kultursystemen in Funktionsbildschirme implementiert werden , um neue Regulatoren der EPDC Mobilisierung für therapeutische Anwendungen in der Herzregeneration zu identifizieren.