Épicardique Excroissance Culture Assay et<em> Ex Vivo</em> Évaluation des épicardique dérivés Migration cellulaire
Özet
Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.
Abstract
Une seule couche de lignées de cellules épicardiques du coeur, en fournissant des facteurs paracrines qui stimulent la prolifération des cardiomyocytes et en contribuant directement progéniteurs cardiovasculaires au cours du développement et de la maladie. Bien qu'un certain nombre de facteurs ont été impliqués dans la cellule (EPDC) mobilisation des épicarde dérivés, les mécanismes qui régissent leur migration ultérieure et la différenciation sont mal comprises. Ici, nous présentons in vitro et ex vivo pour étudier les stratégies EPDC motilité et la différenciation. Tout d'abord, nous décrivons une méthode d'obtention de cellules épicardiques primaires par la culture excroissance du coeur de la souris embryonnaire. Nous présentons également un protocole détaillé pour évaluer la migration tridimensionnelle de EPDC marquée dans un système de culture d'organe. Nous fournissons des preuves à l'aide de ces techniques que la suppression génétique des facteurs de transcription liés Myocardin-dans l'épicarde atténue la migration EPDC. Cette approche sert de plateforme pour évaluer les modificateurs de candidats de EPDCbiologie et pourrait être utilisé pour développer des écrans génétiques ou chimiques pour identifier les nouveaux régulateurs de mobilisation EPDC qui pourraient être utiles pour la réparation cardiaque.
Introduction
L'épicarde est une seule couche de cellules mésothéliales que les lignes du cœur et impacts cardiaque le développement, la maturation et de réparation. Grâce à un échange hautement coordonnée de signaux paracrines, le dialogue intime entre l'épicarde et le myocarde est indispensable pour la croissance cardiaque et la formation de non-myocytes cardiaques lignées 1. Des cellules épicardiques dérivées (EPDC) émergent d'un sous – ensemble de cellules épicardiques par l' intermédiaire d' un épithéliale-mésenchymateuse transition (EMT) 2, envahissent l'espace sous – épicardiques et du myocarde sous – jacente, et se différencient principalement dans les cellules murales vasculaires coronaires et des fibroblastes cardiaques et à un moindre mesure, les cellules et les cardiomyocytes 3-9 endothéliales.
Les mécanismes de régulation de l' EMT épicardique et l' invasion EPDC ont été attribués à l'action coordonnée de diverses molécules , y compris des ligands sécrétés 10-13, des récepteurs de surface cellulaire et des molécules d'adhésion 14,15, réglelateurs de polarité apicale-basale 16,17, petites GTPases 18,19 et facteurs de transcription 2,20,21. Bien que plusieurs des effecteurs moléculaires de la migration EPDC ont été définis, une meilleure compréhension des signaux physiologiques qui stimulent la mobilisation EPDC dans l'embryon peut accélérer le développement de stratégies pour manipuler ce processus chez l'adulte pour une meilleure réparation cardiaque.
Des études visant à identifier de nouveaux régulateurs de mobilisation EPDC comptent sur la purification de cette population de cellules ou localiser la migration des cellules épicardiques individuelles. Ou une combinaison de gènes marqueurs, y compris WT1 Tcf21, Tbx18 et / ou Aldh1a2, est couramment utilisé pour identifier l'épicarde du foetus 1. Cependant, l'utilisation de ces marqueurs pour suivre la migration EPDC est pas optimale comme expression de marqueurs épicardiques diminue au cours du développement du cœur et est souvent perdue lorsque les cellules épicardiques subissent transdifrenciation dans des cellules mésenchymateuses.
L'application du système Cre / loxP, en collaboration avec les journalistes de la lignée de traçage, a été utile dans l' étiquetage de façon permanente l'épicarde et ses descendants au cours du développement du cœur et suite à une lésion ischémique chez l'adulte 7,22,23. Plusieurs lignes Cre épicardiques restreint ont été générés et sont largement utilisés pour étiqueter EPDC et géniques conditionnelle des stratégies de suppression 1. Ces études ont abouti à la caractérisation des différentes lignées épicardique et l'identification des médiateurs essentiels de EPDC motilité et la différenciation. Cependant, l' accumulation de preuves suggère également l'épicarde est une population hétérogène de cellules progénitrices 4,24,25. Ainsi, seul un sous-ensemble de cellules épicardiques sera ciblé en utilisant un pilote Cre donné.
Afin de marquer l'ensemble épicarde indépendamment de la spécificité Cre, un certain nombre de laboratoires ont utilisé cul excroissancesystèmes de ture ou ex vivo des méthodes de culture d'organes pour isoler ou étiqueter les cellules épicardiques sans dépendre de l'expression d'une lignée génétique les marqueurs 26-28 fidèlement. Pour ex vivo études sur la migration, les cœurs embryonnaires sont isolées avant EMT épicardique et cultivées dans un milieu supplémenté avec une protéine fluorescente verte (GFP) exprimant l'adénovirus (Ad / GFP) 9,18. Cette approche permet un marquage efficace de la totalité épicarde plutôt que d'un sous-ensemble de cellules par recombinaison à médiation par Cre. Cultures cardiaques sont ensuite exposés à des inducteurs connus de EMT pour stimuler la mobilisation de EPDC 28,29. Ex vivo et in vivo des analyses sont complétées par des cultures in vitro d' explants épicardiques, qui sont une approche particulièrement utile pour explorer des mécanismes détaillés de conduite migration EPDC.
Ici, nous décrivons les méthodes pour isoler des cellules épicardiques primaires pour les études in vitro de epicardial EMT, ainsi que d' un système de culture d'organes ex vivo analyses de EPDC motilité. Nous avons récemment démontré l'utilité et la robustesse de cette méthode en modulant génétiquement le facteur lié myocardin-transcription (MRTF) / facteur de réponse sérique (SRF) axe de signalisation pour manipuler la migration basée actine de EPDC 9. Bien que nos résultats mettent en évidence une voie nécessaire pour la régulation de la migration EPDC de signalisation, ces méthodes sont appropriées pour démêler les mécanismes qui orchestrent collectivement la migration EPDC et la différenciation. En outre, l'expiant et ex vivo des systèmes de culture pourraient être mises en œuvre dans les écrans fonctionnels pour identifier les nouveaux régulateurs de mobilisation EPDC pour des applications thérapeutiques dans la régénération cardiaque.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons ici des méthodes détaillées pour isoler la cellule épicardique primaire en excroissance et suivre la migration EPDC en ex vivo cultures cardiaques. Pour les cultures excroissance, le moment approprié pour retirer le coeur de épicarde appauvri varie légèrement entre les expériences. Une surveillance périodique des explants après une nuit d'incubation est recommandé de mesurer l'ampleur de la croissance des épicardique et d'extraire le cœur avant fibroblastes apparaissen…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EMS a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (NIH) [numéro de subvention R01HL120919]; l'American Heart Association [numéro de subvention 10SDG4350046]; Université de Rochester CSTC prix du NIH [numéro de subvention UL1 TR000042]; et les fonds de démarrage de la Aab CVRI. MAT a été soutenu en partie par une subvention à l'Université de Rochester School of Medicine et de dentisterie de l'Initiative Howard Hughes Medical Institute Med-Into-Grad; et un prix de service institutionnel Ruth L. Kirschstein national de recherche du NIH [numéro de subvention GM068411].
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH3002201 | DMEM |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Hyclone | SH3003102 | HBSS |
| Medium 199 | Hyclone | SH3025301 | M199 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Hyclone | SH3002802 | DPBS |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | FBS |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Hyclone | SV30010 | |
| Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides | Corning | 354557 | |
| Multiwell 24-well plates | Falcon | 08-772-1 | |
| Dissecting microscope | Leica | M50 | Equipped with Leica KL300 LED might source |
| Confocal miscroscope | Olympus | 1X81 | Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Transforming growth factor beta 1 | R&D Systems | 100-B-001 | TGF-β1 |
| Platelet-derived growth factor BB | R&D Systems | 220-BB-010 | PDGF-BB |
| Trizol Reagent | Applied Biosystems | 15596-026 | Caution, hazardous material |
| TURBO DNA-free Kit | Life Technologies | AM1907 | DNaseI |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891 | |
| UltraPure Glycogen | Life Technologies | 10814-010 | |
| SYBR Green | BioRad | 170-8880 | |
| Protease inhibtor cocktail tablets | Roche | 11836170001 | |
| Alexa Goat-anti-rabbit 488 | Life Technologies | A11008 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-rabbit 594 | Life Technologies | A-11012 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-mouse 594 | Life Technologies | A-11005 | Secondary antibody |
| Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated | Sigma-Aldrich | C6198 | monoclonal antibody, clone 1A4 |
| Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) | Life Technologies | MA1-46028 | monoclonal antibody, clone 6F-H2 |
| Rabbit anti-ZO1 | Life Technologies | 40-2200 | polyclonal antibody |
| Rabbit anti-Collagen Type 4 | Millipore | AB756P | polyclonal antibody |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Life Technologies | D1306 | DAPI |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | |
| 16% Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences | TFM-B | |
| Pap pen | DAKO | S2002 | |
| Disposable mictrotome blades | Sakura Finetek | 4689 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1358W | positively charged, 25 x 75 x 1mm |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Disposable base molds | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| Ketamine | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
Referanslar
- von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
- Martinez-Estrada, O. M., et al. Wt1 is required for cardiovascular progenitor cell formation through transcriptional control of Snail and E-cadherin. Nat Genet. 42, 89-93 (2010).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
- Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
- Wilm, B., Ipenberg, A., Hastie, N. D., Burch, J. B., Bader, D. M. The serosal mesothelium is a major source of smooth muscle cells of the gut vasculature. Development. 132, 5317-5328 (2005).
- Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454, 109-113 (2008).
- Dettman, R. W., Denetclaw, W., Ordahl, C. P., Bristow, J. Common epicardial origin of coronary vascular smooth muscle, perivascular fibroblasts, and intermyocardial fibroblasts in the avian heart. Dev Biol. 193, 169-181 (1998).
- Trembley, M. A., Velasquez, L. S., de Mesy Bentley, K. L., Small, E. M. Myocardin-related transcription factors control the motility of epicardium-derived cells and the maturation of coronary vessels. Development. 142, 21-30 (2015).
- Mellgren, A. M., et al. Platelet-derived growth factor receptor beta signaling is required for efficient epicardial cell migration and development of two distinct coronary vascular smooth muscle cell populations. Circ Res. 103, 1393-1401 (2008).
- von Gise, A., et al. WT1 regulates epicardial epithelial to mesenchymal transition through beta-catenin and retinoic acid signaling pathways. Dev Biol. 356, 421-431 (2011).
- Lavine, K. J., et al. Endocardial and Epicardial Derived FGF Signals Regulate Myocardial Proliferation and Differentiation In Vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
- Sanchez, N. S., Barnett, J. V. TGFbeta and BMP-2 regulate epicardial cell invasion via TGFbetaR3 activation of the Par6/Smurf1/RhoA pathway. Cell Signal. 24, 539-548 (2012).
- Dettman, R. W., Pae, S. H., Morabito, C., Bristow, J. Inhibition of 4-integrin stimulates epicardial-mesenchymal transformation and alters migration and cell fate of epicardially derived mesenchyme. Dev Biol. 257, 315-328 (2003).
- Rhee, D. Y., et al. Connexin 43 regulates epicardial cell polarity and migration in coronary vascular development. Development. 136, 3185-3193 (2009).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Hirose, T., et al. PAR3 is essential for cyst-mediated epicardial development by establishing apical cortical domains. Development. 133, 1389-1398 (2006).
- Baek, S. T., Tallquist, M. D. Nf1 limits epicardial derivative expansion by regulating epithelial to mesenchymal transition and proliferation. Development. 139, 2040-2049 (2012).
- Lu, J., et al. Coronary smooth muscle differentiation from proepicardial cells requires rhoA-mediated actin reorganization and p160 rho-kinase activity. Dev Biol. 240, 404-418 (2001).
- Combs, M. D., Braitsch, C. M., Lange, A. W., James, J. F., Yutzey, K. E. NFATC1 promotes epicardium-derived cell invasion into myocardium. Development. 138, 1747-1757 (2011).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139, 2139-2149 (2012).
- Zhou, B., von Gise, A., Ma, Q., Hu, Y. W., Pu, W. T. Genetic fate mapping demonstrates contribution of epicardium-derived cells to the annulus fibrosis of the mammalian heart. Dev Biol. 338, 251-261 (2010).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
- Singh, M., Epstein, J. Epicardial Lineages and Cardiac Repair. Journal of Developmental Biology. 1, 141-158 (2013).
- Braitsch, C. M., Combs, M. D., Quaggin, S. E., Yutzey, K. E. Pod1/Tcf21 is regulated by retinoic acid signaling and inhibits differentiation of epicardium-derived cells into smooth muscle in the developing heart. Dev Biol. 368, 345-357 (2012).
- Austin, A. F., Compton, L. A., Love, J. D., Brown, C. B., Barnett, J. V. Primary and immortalized mouse epicardial cells undergo differentiation in response to TGFbeta. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 366-376 (2008).
- Kim, J., Rubin, N., Huang, Y., Tuan, T. L., Lien, C. L. In vitro culture of epicardial cells from adult zebrafish heart on a fibrin matrix. Nat Protoc. 7, 247-255 (2012).
- Compton, L. A., Potash, D. A., Mundell, N. A., Barnett, J. V. Transforming growth factor-beta induces loss of epithelial character and smooth muscle cell differentiation in epicardial cells. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 82-93 (2006).
- Smith, C. L., Baek, S. T., Sung, C. Y., Tallquist, M. D. Epicardial-derived cell epithelial-to-mesenchymal transition and fate specification require PDGF receptor signaling. Circ Res. 108, 15-26 (2011).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. JOVE. 2, (2007).
- Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 32, 1026-1035 (2014).
- Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
- Takeichi, M., Nimura, K., Mori, M., Nakagami, H., Kaneda, Y. The transcription factors Tbx18 and Wt1 control the epicardial epithelial-mesenchymal transition through bi-directional regulation of Slug in murine primary epicardial cells. PloS one. 8, e57829 (2013).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 39, 75-85 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Moore, A. W., McInnes, L., Kreidberg, J., Hastie, N. D., Schedl, A. YAC complementation shows a requirement for Wt1 in the development of epicardium, adrenal gland and throughout nephrogenesis. Development. 126, 1845-1857 (1999).
- Kim, J., et al. PDGF signaling is required for epicardial function and blood vessel formation in regenerating zebrafish hearts. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17206-17210 (2010).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, 1420-1428 (2009).
- Dong, X. R., Maguire, C. T., Wu, S. P., Majesky, M. W. Chapter 9 Development of Coronary Vessels. Methods in Enzymology. 445, 209-228 (2008).
- Ruiz-Villalba, A., Ziogas, A., Ehrbar, M., Perez-Pomares, J. M. Characterization of epicardial-derived cardiac interstitial cells: differentiation and mobilization of heart fibroblast progenitors. PLoS One. 8, e53694 (2013).
- Garriock, R. J., Mikawa, T., Yamaguchi, T. P. Isolation and culture of mouse proepicardium using serum-free conditions. Methods. 66, 365-369 (2014).
- Smart, N., Riley, P. Derivation of epicardium-derived progenitor cells (EPDCs) from adult epicardium. Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2009).
- Zhou, B., Pu, W. T. Isolation and characterization of embryonic and adult epicardium and epicardium-derived cells. Methods Mol Biol. 843, 155-168 (2012).
- Morabito, C. J., Dettman, R. W., Kattan, J., Collier, J. M., Bristow, J. Positive and negative regulation of epicardial-mesenchymal transformation during avian heart development. Dev Biol. 234, 204-215 (2001).
- Grieskamp, T., Rudat, C., Ludtke, T. H., Norden, J., Kispert, A. Notch signaling regulates smooth muscle differentiation of epicardium-derived cells. Circ Res. 108, 813-823 (2011).
