To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Nós estabelecemos um modelo de cultura de células epiteliais endodérmico (CEE) para estudar a função de certas enzimas e proteínas na mediação de utilização de nutrientes por embriões de aves durante o desenvolvimento. Fertilizados ovos de codorniz Japonesa foram incubadas a 37 ° C durante 5 dias e, em seguida, yolk sac membranas (YSM) foram recolhidas para se estabelecer o sistema de cultura de CEE. Isolamos a camada endoderma embrionário de YSM, e cortado da membrana em 2 – 3 mm pedaços e parcialmente digerido com colagenase antes de semear em placas de cultura de 24 poços. O EECS proliferam para fora do tecido e estão prontos para os estudos de cultura de células. Descobrimos que o EECS tinha características típicas de YSM in vivo, por exemplo, acúmulo de gotículas lipídicas, expressão de esteróis O-aciltransferase e lipoproteína lipase. O tratamento a digestão parcial aumentou significativamente a taxa de sucesso da cultura CEE. Utilizando o EECS, foi demonstrado que a expressão de SOAT1 foi regulado pelo AMPc dproteína quinase ependent Um caminho relacionado. Este sistema de cultura de codorna japonesa CEE primária é uma ferramenta útil para estudar o transporte de lipídios embrionário e para esclarecer o papel de genes envolvidos na mediação de utilização de nutrientes em YSM durante o desenvolvimento embrionário aviária.
O recurso principal nutricional do embrião aviário é gema, composto de 33% de lípidos, proteínas 17%, e 1% de cinzas. 1 durante o desenvolvimento embrionário, a membrana vitelina (YSM) cresce a partir de dentro da cavidade abdominal embrionário e cobre gradualmente a gema superfície. Começando no dia embrionário 2, a expressão de genes associados com o metabolismo dos lípidos e a angiogénese é gradualmente aumentada em YSM, e o YSM desenvolve lentamente projecções das vilosidades semelhantes. Estas projecções 8,9 aumentar a absorção de nutrientes gema para suportar o desenvolvimento embrionário. O YSM é um tecido extra-embrionário que contém três camadas germinativas, endoderme, mesoderme e ectoderme. 14 do ectoderma saco vitelino enfrenta a clara e links com a membrana vitelina para cobrir suavemente o saco vitelino. As células epiteliais da endoderme são confrontados diretamente para a gema de ovo e servir como portais de utilização de nutrientes. 6 À medida que a ADM se expande, células epiteliais endodérmico (EECS) pode ser dividido por shape e funcionalidade em dois grupos, a área vitelínicas e vasculosa área. 7
vitelina área é composta por células da endoderme e está distante do embrião; vasculosa área é composta por células mesodérmicas e cobre EECS diferenciadas com vasos sanguíneos e tecidos conjuntivos. Por dia embrionário 5, a gema é totalmente coberta por ectoderma e endoderma de YSM ea área vascular tem crescido rapidamente. O YSM absorve, recompõe e liberta lípidos (como-gema derivado lipoproteína de muito baixa densidade) e proteínas no sistema circulatório embrionário. 9, 2 Assim, foi estabelecido um embrionário sistema de codorniz japonesa primária endodérmica epitelial de cultura de células, para estudar os mecanismos de lípido utilização em YSM durante o desenvolvimento embrionário aviária.
Os lípidos tais como triglicerídeos, lecitina, de fosfolípidos e ésteres de colesterol (CE) são as fontes de energia primárias para embriões de aves. Nas fases iniciais de desenvolvimento, lípidos da gema são Composed de apenas 1,3% do CE e ele sobe para 10-15% a meio do período de desenvolvimento embrionário aviária 3, 11. éster de colesterol é sintetizado a partir do colesterol, esteróis O-aciltransferase 1 (SOAT1) em YSM embrião aviária. 4
A forma de armazenamento de colesterol é CE, CE é realizada nas lipoproteínas e lipoproteínas são transportados pela circulação para os tecidos. 13 Uma semana antes escotilha há um crescimento rápido dos embriões de aves. Aproximadamente 68% do conteúdo de lípidos restantes na gema são absorvidos durante esta fase. 10 O mecanismo pelo qual a gema de lípidos são utilizados pode ser clarificada por um modelo de pesquisa CEE. Um protocolo de cultura de frango CEE foi estabelecido para atingir este objectivo de pesquisa. 2, 9 No entanto, devido à baixa taxa de sucesso de explantes de tecidos, um processo de cultura de células CEE melhorada é necessária para estudar a função de certas enzimas e proteínas na mediação de a utilização de nutrientes pelos embriões de aves durante o desenvolvimento.
Uma vez que o sistema de cultura anterior tem apenas um sucesso limitado, é necessário um sistema de cultura melhor. A endoderme codornizes YSM japonesa requer tratamento com enzimas proteolíticas tais como a colagenase para soltar as junções célula-célula para alcançar um melhor desempenho do crescimento nos explantes ex-vivo. Os nossos dados mostram que o número de células de tratamento digestão parcial foi maior do que a partir da cultura de tecido não digerido após a sementeira, durante 2 dias (…
The authors have nothing to disclose.
O financiamento para o desenvolvimento de protocolo atual é particularmente apoiada por "Aim para o Plano Universidade Top", da Universidade Nacional de Taiwan, Taiwan (concessão ID-104R350144), bem como o Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan (ID concessão: a maioria dos 104 -2313-B-002-039-MY3). Agradecemos especialmente o Centro de Biotecnologia da Universidade Nacional de Taiwan para fornecer uma sala de animais e espaço de laboratório para o estudo atual.
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |