Imaging Raziometrico del pH extracellulare nel dentale biofilm

Il metodo qui descritto permette di monitorare pH extracellulare in biofilm dentali nell'intervallo tra 4,5 e 7, utilizzando il colorante raziometrica seminaphthorhodafluor-4F 5- (e-6) di acido carbossilico (C-SNARF-4) in combinazione con microscopio confocale a scansione laser e analisi di immagine digitale. Il colorante fluorescente impiegata è sensibile al pH e visualizza un cambiamento nella sua emissione fluorescente a seconda dello stato di protonazione. L'emissione fluorescente dei picchi molecola protonata a 580 nm, e l'emissione della molecola deprotonata a 640 nm ^1. Il rapporto tra le intensità di emissione fluorescente in due finestre di rilevazione comprendente i due picchi di emissione (576 – 608 nm ei 629 – 661 nm) riflette quindi pH nella fase liquida, indipendentemente dalla concentrazione di colorante. Con un pK _a di ~ 6,4 colorante è adatto per visualizzare pH in ambienti moderatamente acide.

PH in biofilm batterici è di fondamentale importanza per tutti i processi metabolici.Nel caso di biofilm dentali, pH nella matrice extracellulare è il fattore di virulenza chiave per lo sviluppo della carie dentaria. Lunghi periodi con un basso pH al comando di interfaccia biofilm-dente per rallentare la demineralizzazione dello smalto di fondo ^2. A causa della complessa architettura tridimensionale di biofilm, metaboliti, tra cui gli acidi organici, non sono distribuiti uniformemente in tutto il biofilm. Altamente e meno microambienti acidogeni possono essere trovati in prossimità spaziale ^3.

Per decenni, i gradienti di pH verticali in biofilm sono stati registrati con l'aiuto di microelettrodi ^4-6. Mentre offrono una buona risoluzione spaziale a causa della loro dimensione piccola punta, non sono particolarmente adatti per monitorare i gradienti orizzontali. Inoltre, l'inserimento dell'elettrodo disturba il biofilm meccanicamente. tecniche microscopiche a fluorescenza quantitative offrono il vantaggio di visualizzare variazioni di pH nei diversi settori di un biofilm, senza interferire meccanicance. Diversi campi microscopici di vista possono essere scelti liberamente e ripreso più volte per periodi prolungati ^1,7-9. Tuttavia, quando si interpretano immagini microscopiche biofilm, è importante distinguere tra la fluorescenza derivante dalla biomassa microbica e fluorescenza derivante dallo spazio extracellulare. In condizioni acide, pH all'interno delle cellule batteriche è diverso da pH nella matrice extracellulare, come i batteri trasportano attivamente protoni attraverso la membrana cellulare a scapito di adenosina trifosfato ^10. Nel contesto della carie dentale, pH batterica intracellulare non ha un impatto diretto sullo smalto sottostanti, mentre bassi valori di pH extracellulare porta alla demineralizzazione. Una media di pH nelle immagini microscopiche che contengono entrambe le aree prive di batteri e batteri porta a risultati errati. L'uso di altre macchie insieme con il colorante sensibile al pH per visualizzare la biomassa batterica e differenziare tra le aree extra ed intracellulari porta abil rischio di contaminazione fluorescente dello spazio extracellulare e false misurazioni ^11.

La presente manoscritto descrive pertanto l'uso del colorante raziometrica in una duplice funzione; sia come marcatore pH e come una macchia batterica universale. Poiché il colorante è up-concentrato in cellule batteriche, la combinazione di confocale immagini microscopiche e un'accurata procedura di analisi di immagine digitale consente la determinazione del pH extracellulare nel campo tra 4,5 e 7,0 in biofilm dentali sottili.