Özet

Imaging Raziometrico del pH extracellulare nel dentale biofilm

Published: March 09, 2016
doi:

Özet

Un colorante raziometrico pH-sensibile è utilizzato in combinazione con microscopio confocale a scansione laser e analisi di immagine digitale per monitorare pH extracellulare in biofilm dentali in tempo reale.

Abstract

Il pH di biofilm batterici sui denti è di importanza centrale per la carie dentale, una malattia con un'alta prevalenza in tutto il mondo. Nutrienti e metaboliti non sono distribuite in modo uniforme in biofilm dentali. Un complesso gioco di assorbimento da e per la reazione con la materia organica nel biofilm riduce i percorsi di diffusione di soluti e crea pendenze di molecole reattive, tra cui gli acidi organici, in tutto il biofilm. Metodi microscopici fluorescenti quantitativi, come l'imaging tempo di vita di fluorescenza o pH ratiometry, possono essere impiegati per visualizzare pH in diversi microambienti di biofilm dentali. pH ratiometry sfrutta una variazione del pH-dipendente nella emissione fluorescente di coloranti sensibili al pH. Calcolo del rapporto emissione a due diverse lunghezze d'onda permette di determinare pH locale in immagini microscopiche, indipendentemente dalla concentrazione del colorante. Contrariamente a microelettrodi tecnica permette il monitoraggio entrambi gradienti di pH verticali ed orizzontali in tempo reale condisturbare meccanicamente il biofilm. Tuttavia, la cura deve essere presa per distinguere con precisione tra i compartimenti extra-intracellulari e del biofilm. Qui, il colorante raziometrica, seminaphthorhodafluor-4F 5- (e-6) di acido carbossilico (C-SNARF-4) è impiegato per monitorare pH extracellulare in in vivo biofilm dentali coltivate di composizione delle specie sconosciuta. Al momento l'esposizione al glucosio il colorante è up-concentrato all'interno di tutte le cellule batteriche nei biofilm; è quindi usato sia come una macchia batterica universale e come indicatore di pH extracellulare. Dopo l'acquisizione di immagini al microscopio confocale, la biomassa batterica viene rimosso da tutte le immagini utilizzando il software di analisi di immagine digitale, che permette di calcolare esclusivamente pH extracellulare. pH ratiometry con il colorante raziometrico è particolarmente adatto per studiare pH extracellulare in biofilm sottili fino a 75 micron di spessore, ma è limitato al campo di pH tra 4,5 e 7,0.

Introduction

Il metodo qui descritto permette di monitorare pH extracellulare in biofilm dentali nell'intervallo tra 4,5 e 7, utilizzando il colorante raziometrica seminaphthorhodafluor-4F 5- (e-6) di acido carbossilico (C-SNARF-4) in combinazione con microscopio confocale a scansione laser e analisi di immagine digitale. Il colorante fluorescente impiegata è sensibile al pH e visualizza un cambiamento nella sua emissione fluorescente a seconda dello stato di protonazione. L'emissione fluorescente dei picchi molecola protonata a 580 nm, e l'emissione della molecola deprotonata a 640 nm 1. Il rapporto tra le intensità di emissione fluorescente in due finestre di rilevazione comprendente i due picchi di emissione (576 – 608 nm ei 629 – 661 nm) riflette quindi pH nella fase liquida, indipendentemente dalla concentrazione di colorante. Con un pK a di ~ 6,4 colorante è adatto per visualizzare pH in ambienti moderatamente acide.

PH in biofilm batterici è di fondamentale importanza per tutti i processi metabolici.Nel caso di biofilm dentali, pH nella matrice extracellulare è il fattore di virulenza chiave per lo sviluppo della carie dentaria. Lunghi periodi con un basso pH al comando di interfaccia biofilm-dente per rallentare la demineralizzazione dello smalto di fondo 2. A causa della complessa architettura tridimensionale di biofilm, metaboliti, tra cui gli acidi organici, non sono distribuiti uniformemente in tutto il biofilm. Altamente e meno microambienti acidogeni possono essere trovati in prossimità spaziale 3.

Per decenni, i gradienti di pH verticali in biofilm sono stati registrati con l'aiuto di microelettrodi 4-6. Mentre offrono una buona risoluzione spaziale a causa della loro dimensione piccola punta, non sono particolarmente adatti per monitorare i gradienti orizzontali. Inoltre, l'inserimento dell'elettrodo disturba il biofilm meccanicamente. tecniche microscopiche a fluorescenza quantitative offrono il vantaggio di visualizzare variazioni di pH nei diversi settori di un biofilm, senza interferire meccanicance. Diversi campi microscopici di vista possono essere scelti liberamente e ripreso più volte per periodi prolungati 1,7-9. Tuttavia, quando si interpretano immagini microscopiche biofilm, è importante distinguere tra la fluorescenza derivante dalla biomassa microbica e fluorescenza derivante dallo spazio extracellulare. In condizioni acide, pH all'interno delle cellule batteriche è diverso da pH nella matrice extracellulare, come i batteri trasportano attivamente protoni attraverso la membrana cellulare a scapito di adenosina trifosfato 10. Nel contesto della carie dentale, pH batterica intracellulare non ha un impatto diretto sullo smalto sottostanti, mentre bassi valori di pH extracellulare porta alla demineralizzazione. Una media di pH nelle immagini microscopiche che contengono entrambe le aree prive di batteri e batteri porta a risultati errati. L'uso di altre macchie insieme con il colorante sensibile al pH per visualizzare la biomassa batterica e differenziare tra le aree extra ed intracellulari porta abil rischio di contaminazione fluorescente dello spazio extracellulare e false misurazioni 11.

La presente manoscritto descrive pertanto l'uso del colorante raziometrica in una duplice funzione; sia come marcatore pH e come una macchia batterica universale. Poiché il colorante è up-concentrato in cellule batteriche, la combinazione di confocale immagini microscopiche e un'accurata procedura di analisi di immagine digitale consente la determinazione del pH extracellulare nel campo tra 4,5 e 7,0 in biofilm dentali sottili.

Protocol

Il protocollo sperimentale è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico di Aarhus County (M-20.100.032). 1. confocale microscopica calibrazione del Raziometrico Dye Per l'acquisizione delle immagini, utilizzare un microscopio invertito confocale equipaggiato con un incubatore, un obiettivo ad immersione dell'acqua apertura 63X / 1.2-numerica, una linea laser 543 nm e un rivelatore META. Preparare tampone HEPES soluzioni madre (50 mm, portata a pH 4.5-8.5 in passi di unità 0,1 p…

Representative Results

Il metodo presentato consente pH extracellulare monitoraggio scende in differenti microambienti di biofilm dentali nel range di pH da 4,5 a 7 in tempo reale. Se le condizioni sperimentali sono scelti come descritto sopra, pH inizia a cadere in tutte le aree del biofilm poco dopo l'esposizione al glucosio. Quando il pH in un biofilm gocce, cellule batteriche diventano visibili entro breve tempo (<1 min), come il colorant…

Discussion

Monitoraggio microscopico di pH biofilm fornisce diversi vantaggi, rispetto ad elettrodo o microelettrodi misurazioni 4-6. tecniche microscopiche permettono di determinare il pH con una risoluzione spaziale elevata e consentire catturare gradienti di pH orizzontali e verticali in biofilm senza disturbare il biofilm meccanicamente. I precedenti tentativi di monitoraggio del pH microscopico, tuttavia, non sono riusciti a distinguere tra il pH extracellulare e intracellulare nei biofilm 1,7,9. A causa…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Javier E. Garcia e Lene Grønkjær per l'assistenza tecnica e Merete K. Raarup per le discussioni fruttuose. Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Aarhus University Research e Simon Spies Fondazione.

Materials

Zeiss LSM 510 META Zeiss N/A
C-Apochromat 63X water immersion objective Zeiss N/A
XL Incubator PeCON N/A
SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid Life Technologies S23920
Dimethyl sulfoxide Life Technologies D12345
HEPES Life Technologies 11344-041
Costar 96-well black clear-bottom plate Fisher Scientific 07-200-567
Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit) Menzel N/A
Alginate impression material GC Corporation N/A
Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs Axis Dental LS-906
Orthodontic retainer containers Spark Medical Equipment Co., Ltd SK-WDTC01
Sticky wax Dentsply N/A
Chewing paraffin wax  Ivoclar Vivadent AG N/A
Dithiothreitol Sigma Aldrich D0632 Used during preparation of salivary solution
0.45 µm and 0.2 µm syringe filters Sigma Aldrich CLS431220; CLS431219 
daime University of Vienna, Austria http://dome.csb.univie.ac.at/daime
ImageJ NIH, Bethesda, Maryland, USA http://imagej.nih.gov/ij/

Referanslar

  1. Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
  2. Takahashi, N., Nyvad, B. Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process. Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).
  3. Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).
  4. von Ohle, O. C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).
  5. Revsbech, N. P. Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors. Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).
  6. Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. Iridium oxide pH microelectrode. Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).
  7. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy & Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
  8. Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).
  9. Vroom, J. M., et al. Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).
  10. Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci. Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).
  11. Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
  12. Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).
  13. de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).
  14. Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).
  15. Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries. Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).

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Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. J. Vis. Exp. (109), e53622, doi:10.3791/53622 (2016).

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