Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Toshitsugu Fujita; Hodaka Fujii

doi:10.3791/53478

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biyoloji

Выделение конкретных областей генома и идентификации Associated молекул enChIP

Published: January 20, 2016

doi:

10.3791/53478

Toshitsugu Fujita¹, Hodaka Fujii¹

¹Chromatin Biochemistry Research Group, Combined Program on Microbiology and Immunology, Research Institute for Microbial Diseases,Osaka University

Özet

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Abstract

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

Introduction

Идентификация молекул, связанных с конкретными геномных областей, представляющих интерес необходимо для понимания механизмов регулирования геномных функций, таких как транскрипции и эпигенетической регуляции. Хотя несколько методов были разработаны для биохимического анализа конкретных областей генома ^1-7, они широко не используется на этой стадии, потому что присущих им проблем, таких как ограниченное применение (например, только для высокого числа копий локусов или локусов с повторами) и слишком много времени и усилий требуется.

Для того, чтобы выполнить биохимический анализ конкретных областей генома легко, мы разработали два локуса конкретных иммунопреципитации хроматина (чип) технологий, а именно инсерционный чип (iChIP) ^8-13 и инженерии ДНК-связывающего молекулы ChIP-опосредованной (enChIP) ^14-17 , В iChIP, локус интереса помечены вставки последовательностей распознавания экзогенного ДНК-связывающего белка, такие как LexА. Локус затем выделяют с помощью аффинной очистки с использованием меченый ДНК-связывающий белок. В enChIP, инженерные ДНК-связывающие молекулы, такие как цинк-пальцевых белков, транскрипции активаторов, как (TAL) белков, и кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPR) комплексы, которые используются, чтобы пометить локус интерес (Рисунок 1). Впоследствии геномной области выделяют аффинной очистки меченых молекул в ДНК-связывающих.

Одним из преимуществ над enChIP iChIP, что введение последовательности узнавания экзогенного ДНК-связывающего белка не является необходимым. Ориентация локусов, используя CRISPR комплексы, состоящие из каталитически неактивной формы Cas9 (dCas9) и руководство РНК (gRNA) гораздо проще, чем таргетинг этих регионах по iChIP или enChIP использованием TAL и цинк-пальцев белки. Здесь мы опишем шаг за шагом протокол enChIP в сочетании с масс-спектрометрии и секвенирования РНК (РНК-Seq), чтобы определить локус-AssociaTed белки и РНК, соответственно.

Protocol

1. Проектирование инженерии ДНК-связывающих молекул признавая локуса-мишени Для enChIP использованием CRISPR комплексы, использовать CRISPRdirect веб-инструмент (http://crispr.dbcls.jp) для определения кандидата gRNA последовательности-мишени в геномной области интереса, как описано ранее 18. Этот веб-инструмент возвращает 23 б.п. геномных участков виде 5'-N 20 NGG-3 »в рамках целевой области. Синтезировать gBlock включая U6 промоторной последовательности и последовательность 5'-N 20 в 5'-N 20 NGG-3 ', используя коммерческие услуги (рис 2) 19,20. Для целей субклонированием, включать в себя соответствующие сайты рестрикции пределами gBlock. Вставьте gBlock в соответствующий вектор, как описано выше 16. Несколько ретровирусные векторы для gBlocks доступны (см Материалы). Для enChIP использованием TAL белки, дизайн TAL белки, распознающие Тарги др локусов. Создание плазмиды, кодирующие белки TAL, используя коммерческие услуги. Генерирование векторов экспрессии, содержащих белки, слитые TAL с одним или несколькими метками, такими как 3 × FLAG, как описано выше 15. 2. Установление клеток для анализа enChIP Экспресс 3 × FLAG-dCas9 и gRNA (процедура CRISPR основе) или 3 × FLAG-ТАЛ (процедура на основе белков TAL) в клетках, которые будут проанализированы, как описано выше 14-17. Использование временной трансфекции, если эффективность трансфекции является высокой. Вектор экспрессии, содержащий 3 × FLAG-dCas9 и промотор CMV доступно (см Материалы). Рассмотреть вопрос о создании стабильных трансформантов с использованием обычных методов, если переходный эффективность трансфекции является низким. В дополнение к вышеупомянутым ретровирусных векторов для gBlock, ретровирусные векторы 3 × FLAG-dCas9 доступны (см Материалы). <li> Подтверждение экспрессии 3xFLAG-dCas9 или 3xFLAG-TAL белка в трансфицированных клетках по иммуноблот-анализа с использованием анти-FLAG антитела (Ab), как описано ранее 14-17. Примечание: Экспрессия этих белков также помечены может быть подтверждено окрашиванием внутриклеточных анти-FLAG-FITC и последующего анализа FACS. Протокол внутриклеточного окрашивания может быть загружен с нашего сайта (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html). Подтвердите выражение gRNA по стандартной методике RT-PCR. Для количественного определения белков, взаимодействующих с геномной области интереса, рассмотреть возможность использования стабильного изотопа в аминокислотами в культуре клеток (SILAC) анализа в сочетании с enChIP (enChIP-SILAC). Примечание: Медиа для анализа SILAC можно приобрести у коммерческих поставщиков. SILAC является мощным в выявлении конкретных взаимодействий. Культура клеток в среде SILAC тяжелой. Подготовка клетки cultuкрасный SILAC света среде в качестве отрицательного контроля. Используйте по крайней мере 5 × 10 7 клеток для каждого SILAC среды (тяжелой или легкой). Для эффективного маркировки, добавить как L-лизин-2HCl, 13 C 6 и L-аргинин-HCl, 13 C 6, 15, N 4 в СМИ SILAC тяжелым. Примечание: По крайней мере, пять клеточных делений необходимы для белков этикеток. Например, культура человека фибросаркомы клетки НТ1080, стабильно экспрессирующие 3xFLAG-dCas9 и gRNA при 37 ° С и 5% СО 2 в DMEM средств массовой информации для SILAC и диализовали эмбриональной бычьей сыворотки с лизин-2HCl плюс L-аргинин-HCl (Свет среде) или 13 С 6 L-лизин-2HCl плюс 13 С 6 15 N 4 L-аргинин-HCl (Тяжелая среда) (см Материалы) 16. Добавить 50 мг легкой или тяжелой L-лизин-2HCl и L-аргинина-НСl в 500 мл среды. Trypsinize и replate клетки, прежде чем они сливаются, так что клетки сохраняют экспоненциальный growtчас 3. Сшивание клеток с формальдегидом Для клеток в суспензионной культуре, передачи 2 × 10 7 клеток, экспрессирующих 3xFLAG-TAL белки или 3xFLAG-dCas9 плюс gRNA и приостановить в 30 мл обычной культуральной среде в 50 мл центрифужную пробирку. Когда больше используют клетки, увеличение объемов и количество реагентов пропорционально. Для SILAC экспериментов, смешать клеток, культивируемых в среде тяжелой или легкой среды (5 х 10 7 клеток в каждом) и разделить в общей сложности 1 х 10 8 клеток в пробирки, содержащие 5 2 х 10 7 клеток. Добавить 810 мкл 37% формальдегида в 30 мл клеточной суспензии (конечная концентрация 1%), и инкубировали при 37 ° С в течение 5 мин. Для адгезивных клеток, непосредственно исправить клеток в культуральные чашки, добавив 810 мкл 37% формальдегида в 30 мл культуральной среды. Остановка сшивание добавлением 3,1 мл 1,25 М раствора глицина (конечная концентрация 127 мМ), аинкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин. Собирают клетки центрифугированием (300 × г в течение 5 мин при 4 ° С). Осторожно удалите супернатант в том числе формальдегид и хранить его в соответствующем бутылки отходов. Для адгезивных клеток, отделить клетки с клеточным скребком и урожая в 50 мл пробирку, и клетки собирают, как описано в данном шаге. Для SILAC экспериментов, смешать отдельные клетки культивировали в тяжелой среде или легкой среды (5 х 10 7 клеток в каждом), разделить общей сложности 1 × 10 8 клеток в 5 пробирок, содержащих 2 х 10 7 клеток, и собрать клетки, как описано в этом шаг. Промыть осадок клеток с 30 мл PBS на пробирку дважды. Осторожно удалите супернатант в том числе формальдегид и хранить его в соответствующем отходов bottle.Handle формальдегида отходы в соответствии с руководящими принципами химических безопасности. Фиксированные клетки могут быть заморожены и хранили при -80 ° С. 4. Подготовка хроматина (за 2 х 107 клеток) Приостановка фиксированные клетки в 10 мл буфера для лизиса клеток (10 мМ Трис (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 0,5% IGEPAL СА-630 и 1 × ингибиторов протеазы) и инкубировать на льду в течение 10 мин. Центрифуга образец (830 × г при 4 ° С в течение 8 мин) и тщательно отбросить супернатант. Приостановка осадок в 10 мл лизирующего буфера ядерного (10 мМ Трис (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 0,5 М NaCl, 1% Тритон Х-100, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,5% лауроилсаркозин и ингибиторы протеазы 1x). Инкубируют на льду в течение 10 мин и вихревых каждые 2-3 мин. Центрифуга образца (830 × г при 4 ° С в течение 8 мин) и тщательно отбросить супернатант. Промыть гранулу в 10 мл PBS. Осадок (хроматина фракции) может быть хранили при -80 ° С, после немедленного замораживания в жидком азоте. 5. ультразвуком хроматина (за 2 х 10 7 клеток) Приостановить хроматина фракции в 800 мклмодифицировано буфера для лизиса 3 (10 мМ Трис (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 0,1% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS, и ингибиторы протеазы 1x) и передать в 1,5 мл пробирку. Разрушать ультразвуком хроматина с помощью ультразвукового (см Материалы) и следующие условия: Выход: 3; обязанность: 100% (непрерывный); и время: бесплатно. Выполнение 10-18 циклов обработки ультразвуком в течение 10 сек и охлаждении на льду в течение 20 сек. Чтобы избежать чрезмерного нагрева, инкубировать образцы на льду в течение 2 мин через каждые 5-6 циклов. Чтобы избежать вспенивания, сохранить положение кончика зонда обработки ультразвуком 0,5 см выше нижней части трубы. Центрифуга образца при (16000 × г при 4 ° С в течение 10 мин) и супернатант передачи в 1,5 мл пробирку. Озвученную хроматина можно хранить при -80 ° С, после немедленного замораживания в жидком азоте. 6. Оценка хроматина фрагментации Смешайте 10 мкл фрагментированной хроматина с 85 мкл дистиллированной воды. Добавьте 4 мкл5 М NaCl и инкубировать при 65 ° CO / N. Добавить 1 мкл 10 мг / мл РНКазы А и инкубируют при 37 ° С в течение 45 мин. Добавьте 2 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0), 4 мкл 1 М Трис (рН 6,8), и 1 мкл 20 мг / мл протеиназы К, а затем инкубируют при 45 ° С в течение 1,5 ч. Отдельные 10 мкл образца с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, который не содержит окрашенные красители, такие как SYBR Green. Пятно гель оценить распределение длин фрагментированной хроматина. Условия, которые генерируют среднюю длину 0,5-2 кб (диапазон 0,2-4 кб) рекомендуется. Очищают ДНК из остальных образцов по экстракции фенолом и хлороформом или с помощью набора для экстракции ДНК (см Материалы). Очищенную ДНК можно использовать в качестве входного ДНК оценить выход enChIP анализов (см 8.11). 7. Подготовка Dynabeads сопряженных с антителами (за 2 х 10 7 клеток) Заранеечистить два 1,5 мл трубки, один для предварительной очистки с помощью обычного IgG мыши, а другой для инкубации с анти-FLAG Ab. Добавить 150 мкл белка G-сопряженных магнитных шариков (см Материалы) в каждую пробирку. Поместите трубки на магнит стоять и ждать в течение 3 мин. Жидкость над осадком сливают с помощью пипетки. Приостановка бусины в 1 мл PBS, содержащий 0,01% Твин-20 (PBS-T). Поместите трубки на магнитной подставке и ждать в течение 2 мин. Удалите супернатант с помощью пипетки, а затем повторите этот шаг. Приостановка бусины в 1 мл PBS-T, содержащем 0,1% БСА. Добавить 15 мкг нормальной IgG мыши или анти-FLAG Ab и вращаются на 4 ° CO / N. Спин вниз кратко, то поместите пробирки на магнитном стоять и ждать в течение 3 мин. Жидкость над осадком сливают с помощью пипетки. Приостановить бисером в 1 мл PBS-T. Обратить образец несколько раз, и спин вниз кратко. Место труб на магнитном стоять и ждать в течение 3 мин, а затем отбросить супернатант с помощью пипетки. Повторите мытьеще два раза с PBS-T (общее из трех стадий промывки). 8. хроматина Иммунопреципитация (за 2 х 10 7 клеток) Смешайте фрагментированный хроматин, полученного в 5.3) (приблизительно 800 мкл) с одной пятой объема (примерно 200 мкл) модифицированного буфера для лизиса 3, содержащей 5% Triton X-100 (конечная концентрация 1% Тритон Х-100). Добавьте хроматина решение трубки, в которой протеин G-конъюгированные магнитные шарики, конъюгированные с нормальной мыши IgG были получены. Поворот при 4 ° С в течение 1 часа. Поместите пробирку на магнитной подставке и ждать в течение 3 мин. Перенести супернатант в трубку, в которой белок G-сопряженные магнитные шарики, сопряженные с анти-FLAG Ab были подготовлены. Поворот при 4 ° CO / N. Поместите пробирку на магнитной подставке и ждать в течение 3 мин. Жидкость над осадком сливают с помощью пипетки. Приостановка бусины в 1 мл буферного раствора с низким (20 мМ Трис (рН 8,0), 2 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 1% тройногот Х-100, 0,1% SDS, и ингибиторы протеазы 1x) и вращать при 4 ° С в течение 5 мин. Поместите пробирку на магнитной подставке и ждать в течение 3 мин. Жидкость над осадком сливают с помощью пипетки и повторить стадии промывки. Промыть шарики с высоким содержанием соли буфера (20 мМ Трис (рН 8,0), 2 мМ ЭДТА, 500 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 0,1% SDS, и 1x ингибиторов протеазы) дважды. Промыть шарики с LiCl-буфере (10 мМ Трис (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 250 мМ LiCl, 0,5% IGEPAL СА-630, 0,5% дезоксихолат натрия, и ингибиторы протеазы 1x) дважды. Промыть шарики с TBS-IGEPAL СА-630 (50 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 0,1% IGEPAL СА-630, и ингибиторы протеазы 1x) один раз. Приостановка бусины в 200 мкл буфера для элюции (50 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 0,1% IGEPAL СА-630, 1x ингибиторы протеазы и 500 мкг / мл 3 × FLAG пептид) и инкубируют при 37 ° С в течение 20 мин. Поместите пробирку на магнитной подставке и ждать в течение 3 мин. Передача супернатант в новую пробирку 1,5 мл и повторить Elutионная шаг. Очищают ДНК из небольшой части (например, 5%) элюата путем экстракции фенол-хлороформ или с помощью набора для экстракции ДНК (см Материалы). Очищенную ДНК можно использовать для ПЦР с наборами праймеров конкретных оценить выходы enChIP анализ по сравнению с входным ДНК, полученной на стадии 6.7, как описано ранее 14,16. 9. SDS-PAGE, окрашивания и анализа Масс-спектрометрический Смешайте элюата (400 мкл) с 1 мл 2-пропанола, 50 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2), и 5 мкл 20 мг / мл гликогена. Осадок хроматина при -20 ° CO / N. Центрифуга образец (16000 × г при 4 ° С в течение 30 мин) и отбросить супернатант. Промыть гранулу с 1 мл 70% -ного этанола и центрифугируют снова (16000 х г при 4 ° С в течение 10 мин). Удалите супернатант полностью с помощью пипетки. Приостановка осадок в 40 мкл 2x буфера для образца (125 мМ Трис (рН 6,8), 10% 2-Mercaptoethanol, 4% ДСН, 10% сахароза и 0,004% бромфенолового синего). Вихревые в течение 5 мин для полного растворения осадка, а затем инкубируют при температуре 100 ° С в течение 30 мин для денатурации белков и обратной сшивки. Для SDS-PAGE, запустить 40 мкл образца на гель, пока краситель не достигнет 1 см ниже скважины. Примечание: Обычно мы используем 4-20% градиентные гели, но и другие гели% могут быть использованы. Пятно гель кумасси бриллиантовым голубым или серебром. Вырезать гель на пять частей (2 мм высоты). Выполните в гелевой пищеварения и масс-спектрометрического анализа, как описано ранее 13-16. Для SILAC экспериментов с 5 х 10 7 клеток друг (всего 1 х 10 8 клеток), приостановить осадок от первых пяти трубок в 40 мкл 2x буфера для образца (не нужно наращивать). 10. Очистка РНК и РНК-Seq анализа Для очистки РНК после enChIP, добавляют 5 ЕД / мл РНКазы ингибитора (SEе) материалы на все буферных растворов, кроме модифицированного буфера для лизиса 3 и буфер для элюции, к которому добавить 40 ед / мл РНКазы ингибитора. Смешайте элюата (400 мкл) с 16 мкл 5 М NaCl и инкубируют при 65 ° С в течение 2 ч. Добавить 1 мл кислоты гуанидиния-фенола на основе реагента (см Материалы) к образцу. Вихревые в течение 15 сек, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 5-15 мин. Центрифуга образца в течение 15 мин при 12000 г и КТ. Передача супернатант в новую пробирку 1,5 мл и добавляют 5 мкл р-броманизола. Вихревые в течение 15 сек, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 3-5 мин. Центрифуга образца в течение 10 мин при 12000 г и КТ. Передача супернатант (приблизительно 1 мл) в новую пробирку 2 мл и добавляют 1 мл 2-пропанола. Переверните пробирку и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Загрузите смеси на колонке в комплекте очистки с РНК (см Материалы). Центрифуга колонку в течение 1 мин при 12000 г и РТ. мытьстолбец с 400 мкл промывочного буфера РНК в комплект очистки с РНК (см Материалы). Добавить 80 мкл ДНКазы I коктейль (смесь 5 мкл ДНКазы I (1 ед / мкл), 8 мкл 10 × ДНКазы I реакционного буфера, 3 мкл ДНКазы / РНКазы воды и 64 мкл РНК промывочного буфера в системой очистки РНК комплект (см Материалы)) на колонке. Инкубируйте образца при 37 ° С в течение 15 мин, а затем центрифуги в течение 30 сек при 12000 х г и КТ. Промыть колонку с 400 мкл РНК Предварительная стирка буфера в комплект очистки с РНК (см Материалы) дважды. Элюции РНК с 50 мкл ДНКазы / РНКазы воды. Элюированный РНК могут быть использованы для РНК последовательности.

Representative Results

В целом, 1-30% целевых областей генома может быть очищен с помощью enChIP. Рисунок 3 включает в себя представительные данные, показывающие выход enChIP анализ ориентации теломеры и промотор интерферона (ИФН) регуляторного фактора-1 (IRF-1) гена. В качестве примеров типичных результатов, таблица 1 перечисляет белки, связанные с IRF-1 промоутера в IFN, специфичных образом идентифицированной enChIP-SILAC, таблица 2 перечислены теломер-связывающие белки, определенные enChIP в сочетании с масс-спектрометрии (enChIP-МС) и таблице 3 приведены РНК, связанные с теломер, определенных enChIP-РНК-Seq. Рисунок 1. Обзор enChIP. enChIP помощью CRISPR (A, B) и Таль (С, D, Е </сильный>) показано. Локус интерес помечен инженерных молекул ДНК-связывающий такой как белок TAL или CRISPR системы, состоящей из каталитически неактивной формы Cas9 (DCAS) и направлять РНК (gRNA). Молекулярные взаимодействия фиксируются с формальдегидом или другими сшивающими агентами, если это необходимо. Впоследствии, фиксированная хроматин фрагментирован с помощью ультразвука или ферментативного пищеварения. Маркированные геномные области очищают аффинной очистки. Наконец, сшивка вспять, и взаимодействующие молекулы (геномные регионы, РНК и белки) идентифицируются при помощи следующего поколения секвенирования и масс-спектрометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. Последовательность gBlock. Метро U6 промотор (в черном), Г нуклеотид бEfore последовательность руководство (в синем), руководство последовательность (gRNA спейсер) (в красном), последовательность леса (зеленый цвет), и последовательность терминатора (оранжевым цветом) показаны. Рисунок 3. Урожайность представителя enChIP анализов. (A) в процентах входы для цели IRF-1 локуса и нецелевого Sox2 локуса. (Б) процент входы для целевых теломер и нецелевых гамма-спутников. Цифры были адаптированы и изменены от предыдущих изданий 15,16. Категории Белки Транскрипция DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo гомолог, PURβ, активируется РНК-полимераза II транскрипции активатор р15, BTF3, Myb связываниябелок 1A Гистонов деацетилирование, компоненты корепрессора RBBP4, PA2G4, TBL3 Ацетилтрансфераза Белок аргинин N-метилтрансферазы 1 Топоизомеразы ДНК ДНК топоизомеразы 2α Гистоны Гистонов H2A.Z гистонов H3.2 Таблица 1:. Примеры белков, связанных с человеческим IRF-1 промоторной области в IFN, специфичных образом идентифицированной enChIP-SILAC Таблица была адаптирована из предыдущей публикации 16. Категории Белки Млекопитающих теломер-связывающие белки ПМЛ, РПА, CDK1, PARP1, PCBP1 Теломер-бидача белки у дрожжей или другие организмы IMP4 Белки, взаимодействующие с теломер-связывающего белки [связанные теломер-связывающий белок] ДНК-полимераза α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FOXP2-РОТ1], Exportin-5 [трет], GNL3L [TRF1], Exportin-1 [трет], 14-3-3 [трет] Белки локализующие для гетерохроматина BEND3 Белки регулирования эпигенетические KDM5C Белки, чьи мутации затрагивают функцию теломер ДНК-полимеразы α (POLA1), HAT1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, глутамат-цистеин лигазы, глутаредоксин, SMRC1 Таблица 2:. Примеры белков, связанных с теломер мыши, определенных enChIP-МС стол был ADAPTEd из предыдущей публикации 15. Категории РНК Компоненты теломеразы TERC, Rmrp Теломерной РНК Террас scaRNAs Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 Н / АСА snoRNAs Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a C / D snoRNAs Snord17, Snord15a, Snord118 lncRNA Neat1 Таблица 3: Примеры РНК, связанных с теломер мыши, определенных enChIP-РНК-Seq Таблица была адаптирована из предыдущей публикации 17..

Discussion

Here, we describe the purification of specific genomic regions using engineered DNA-binding molecules such as the CRISPR system and TAL proteins, and the identification of proteins and RNAs bound to these genomic regions. Binding of engineered DNA-binding molecules to the genome may affect chromatin structure, including nucleosome positioning, and may abrogate genomic functions, as described in CRISPR interference experiments²¹. To avoid these potential aberrant effects, we propose specific guidelines for choosing target genomic regions. First, to avoid potential inhibition of the recruitment of RNA polymerases and transcription factors, as well as disruption of nucleosome positioning around the transcription start site, the target regions for analyses of promoter regions should be several hundred base pairs upstream of (5′ to) the transcription start site. By contrast, when analyzing genomic regions with distinct boundaries, such as enhancers and silencers, genomic regions that are directly juxtaposed to these regions can be targeted because it is less likely that the binding of engineered DNA-binding molecules will affect their functions. Furthermore, it is best to avoid using target regions that are conserved among different species, because important DNA-binding molecules often bind to evolutionarily conserved regions and inhibition of their binding might disrupt the functions of the target genomic regions. In this regard, it is always necessary to check that the function of the target genomic region is maintained in the established cells used for enChIP analyses. Because multiple gRNAs can be tested easily and it is tedious and expensive to generate multiple versions of TAL or zinc-finger proteins recognizing different target genomic regions, enChIP using CRISPR is more advantageous than enChIP using other proteins.

It has been shown that dCas9 binds to off-target sites although affinity to those sites might be weaker than that to the target sites^22-25. There are several ways to manage contamination of molecules bound to those off-target sites. First, the use of several, at least two, different gRNAs would be recommended. Those molecules commonly observed in enChIP using distinct gRNAs would be true positives. Second, comparison of different conditions for enChIP would be effective in cancelling contamination of non-specific molecules and molecules bound to off-target sites. Examples of those comparison sets would be (i) stimulation (-) and (+), or (ii) different cell types such as T cells vs. B cells. Finally, quantitative analysis of binding of candidate molecules should be performed to confirm their specific binding to the target sites. It is preferable to prepare cells expressing only dCas9 but not gRNA as a negative control.

Using enChIP analyses, we were able to successfully identify a number of known and novel molecules interacting with specific genomic regions (Tables 1-3)^14-17. However, this technique failed to detect some other known proteins interacting with these regions. For example, STAT1 reportedly associates with the IRF-1 promoter upon IFNγ stimulation⁸, but our enChIP-SILAC analysis did not detect STAT1 as a protein induced to interact with this genomic region¹⁶. In addition, in the enChIP-MS analysis of telomeres, we did not detect shelterin proteins consisting of TRF-1 and TRF-2¹⁵, which have been shown to interact with telomeres²⁶. There are a few potential reasons for these discrepancies. First, the stoichiometry of binding of Stat1 to the IRF-1 promoter might be very low. It is reasonable that enChIP-MS, including enChIP-SILAC, detects proteins that are more abundantly associated with target genomic regions; hence, the analysis of more cells might be necessary to detect these proteins. Increases in the sensitivities of MS instruments would also contribute to the efficient detection of proteins with low stoichiometric binding. Second, some proteins, possibly including Stat1 and shelterins, might be difficult targets for MS analyses. Third, in our analysis of telomere-binding proteins¹⁵, the 3×FLAG-TAL proteins recognizing telomeres (3×FN-Tel-TAL) might have blocked the binding of shelterins to telomeres in a competitive fashion.

In contrast to the relative difficulty of detecting transcription factors binding to specific genomic regions using enChIP, we successfully identified epigenetic regulators such as histone modification enzymes using enChIP analyses. The success of this technique may be due to the fact that epigenetic regulators bind to a broad range of genomic regions; hence, more proteins per genomic region are available for MS. Because epigenetic regulators are increasingly recognized as important targets for drugs against intractable diseases such as cancer, enChIP would be a useful tool for the identification of epigenetic drug targets.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Takeda научного фонда (TF); Асахи Стекло Фонд; Мемориал Фонд Уэхара (ВЧ); Kurata Мемориал Hitachi Наука и техника фонд (ТФ и ВЧ); Грант-в-помощь для молодых ученых (B) (# 25830131), Грант-в-помощь по научным исследованиям (C) (# 15K06895) (TF); и Грант-в-помощь для научных исследований в "Транскрипция цикла 'инновационных направлений (# 25118512 & # 15H01354), Грант-в-помощь для научных исследований (B) (# 15H04329), Грант-в-помощь для поисковых исследований ( # 26650059) и «Геном поддержки" (# 221S0002) (ВЧ) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии.

Materials

gBlock synthesis service	Life Technologies	Gene Synthesis by GeneArt
gBlock synthesis service	IDT (Integrated DNA Technologies)	gBlocks Gene Fragments
pSIR-neo	Addgene	51128
pSIR-GFP	Addgene	51134
pSIR-DsRed-Express2	Addgene	51135
pSIR-hCD2	Addgene	51143
TAL synthesis service	Life Technologies	GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1	Addgene	47948
3×FLAG-dCas9/pMXs-puro	Addgene	51240
3×FLAG-dCas9/pMXs-IG	Addgene	51258
3×FLAG-dCas9/pMXs-I2	Addgene	51259
3×FLAG-dCas9/pMXs-neo	Addgene	51260
anti-FLAG M2 Ab	Sigma-Aldrich	F1804
FITC-conjugated anti-FLAG M2	Sigma-Aldrich	F4049
DMEM medium for SILAC	Life Technologies	89985	Other medium can be purchased from Life Technologies
Dialyzed FBS for SILAC	Life Technologies	89986
L-Lysine-2HCl for SILAC	Life Technologies	89987	for Light medium
L-Arginine-HCl for SILAC	Life Technologies	89989	for Light medium
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC	Life Technologies	89988	For Heavy medium
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC	Life Technologies	89990	For Heavy medium
Complete, mini, EDTA-free	Roche Diagnostics	4693159
Ultrasonic Disruptor UD-201	Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D5205
Dynabeads-Protein G	Life Technologies	DB10004
RNasin Plus RNase Inhibitor	Promega	N2611
Isogen II	Nippon Gene	311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2050
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific		a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
nanoLC	Advance, Michrom Bioresources		a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
HTC-PAL autosampler	CTC Analytics		a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis

Referanslar

Zhang, X. Y., Horz, W. Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse. Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).
Workman, J. L., Langmore, J. P. Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin. Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).
Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).
Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. Purification and initial characterization of primate satellite chromatin. Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).
Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).
Ghirlando, R., Felsenfeld, G. Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn. J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).
Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
Hoshino, A., Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).
Fujita, T., Fujii, H. Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One. 6, e26109 (2011).
Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).
Fujita, T., Fujii, H. Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation. ISRN Biochem. 2013, 913273 (2013).
Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins. BMC Mol. Biol. 15, 26 (2014).
Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells. PLoS One. 10, (2015).
Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).
Fujita, T., et al. Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP). Sci. Rep. 3, 3171 (2013).
Fujita, T., Fujii, H. Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR. PLoS One. 9, e103084 (2014).
Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing. PLoS One. 10, e0123387 (2015).
Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Biyoinformatik. , (2014).
Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).
Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).
Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).
Cencic, R., et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. PLoS One. 9, 109213 (2014).
O’Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture. Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).
de Lange, T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).

Etiketler

EnChIP Genomic Region Isolation Molecular Interactions Transcription Epigenetic Regulation DNA-binding Molecules FLAG-dCas9 FLAG-TAL Cross-linking Formaldehyde Glycine Chromatin Extraction Lysis Buffer Nuclear Lysis Buffer

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Fujita, T., Fujii, H. Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP. J. Vis. Exp. (107), e53478, doi:10.3791/53478 (2016).