L'isolamento di regioni genomiche specifici e l'identificazione di molecole da Associated enChIP

1. Progettazione di Engineered molecole di DNA-binding Riconoscere il Target Locus Per enChIP utilizzando complessi CRISPR, utilizzare lo strumento web CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) per identificare sequenze candidato bersaglio gRNA nella regione genomica di interesse descritto come precedentemente 18. Questo strumento web riporta 23 bp siti genomici della forma 5'-N 20 NGG-3 'all'interno della regione di destinazione. Sintetizzare un gBlock compresa la sequenza del promotore U6 e la sequenza di 5'-N 20 in 5'-N 20 NGG-3 'utilizzando servizi commerciali (vedi Figura 2) 19,20. Ai fini subcloning, includere preposti per enzimi di restrizione al di fuori del gBlock. Inserire il gBlock in un vettore adeguato come descritto in precedenza 16. Diversi vettori retrovirali per gBlocks sono disponibili (vedi Materiali). Per enChIP utilizzando proteine ​​TAL, progettare proteine ​​TAL riconoscendo la target loci. Generare plasmidi che codificano per proteine ​​TAL che utilizzano i servizi commerciali. Genera vettori di espressione contenenti le proteine ​​TAL fusi con una o più variabili come 3 × FLAG come descritto in precedenza 15. 2. Istituzione di cellule per l'analisi enChIP Esprimere 3 × FLAG-dCas9 e il gRNA (procedura basata CRISPR-) oppure 3 × FLAG-TAL (TAL procedura a base di proteine) nelle cellule per essere analizzato come descritto in precedenza 14-17. Utilizzare trasfezione transiente se l'efficienza di trasfezione è alta. Un vettore di espressione contenente 3 × FLAG-dCas9 e il promotore CMV è disponibile (vedi Materiali). Considerare l'istituzione di trasformanti stabili con metodi convenzionali se l'efficienza di trasfezione transiente è bassa. In aggiunta ai suddetti vettori retrovirali per gBlock, vettori retrovirali di 3 × FLAG-dCas9 sono disponibili (vedi Materiali). <li> Conferma l'espressione del 3xFLAG-dCas9 o proteine ​​3xFLAG-TAL nelle cellule trasfettate mediante analisi immunoblot usando un anticorpo anti-FLAG (Ab) come descritto in precedenza 14-17. Nota: L'espressione di queste proteine ​​con tag può anche essere confermata mediante colorazione intracellulare con anticorpi anti-FLAG-FITC e una successiva analisi FACS. Un protocollo per la colorazione intracellulare può essere scaricato dal nostro sito internet (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html). Conferma espressione del gRNA dalla tecnica standard RT-PCR. Per l'identificazione quantitativa di proteine ​​che interagiscono con la regione genomica di interesse, prendere in considerazione l'uso di un sistema di etichettatura isotopo stabile da aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC) analisi combinata con enChIP (enChIP-SILAC). Nota: supporto per l'analisi SILAC possono essere acquistati da fornitori commerciali. SILAC è potente nel rilevare interazioni specifiche. Cellule di coltura in SILAC medio pesante. Preparare cellule culturosso in mezzo luce SILAC come controllo negativo. Utilizzare almeno 5 × 10 7 cellule per mezzo SILAC (pesante o leggero). Per l'etichettatura efficiente, aggiungere sia L-lisina-2HCl, 13 C 6 e L-Arginina-HCl, 13 C 6, 15 N 4 nei media SILAC pesanti. Nota: Almeno cinque divisioni cellulari sono necessari per le proteine ​​di etichette. Per esempio, la cultura umana cellule fibrosarcoma HT1080 esprimono stabilmente 3xFLAG-dCas9 e un gRNA a 37 ° C e 5% di CO 2 in DMEM media per la SILAC e siero fetale bovino dializzato con lisina-2HCl più L-Arginina-HCl (medio chiaro) o 13 C 6 L-lisina-2HCl più 13 C 6 15 N 4 L-arginina-HCl (medio pesante) (vedi Materiali) 16. Aggiungere 50 mg di leggera o pesante L-lisina-2HCl e L-arginina-HCl in 500 ml di terreno. Cellule trypsinize e replate prima che diventino confluenti modo che le cellule mantengono growt esponenzialeh. 3. La reticolazione di Celle con formaldeide Per le cellule in coltura in sospensione, trasferimento 2 × 10 7 cellule che esprimono proteine ​​3xFLAG-TAL o 3xFLAG-dCas9 più gRNA e sospendere in 30 ml di terreno di coltura normale in una provetta da centrifuga da 50 ml. Quando si utilizzano più celle, aumentare i volumi e le quantità di reagenti proporzionalmente. Per gli esperimenti SILAC, mescolare le cellule coltivate in terreno pesante o leggero medio (5 x 10 7 cellule ciascuno) e dividere il totale di 1 x 10 8 cellule in 5 provette contenenti 2 x 10 7 cellule. Aggiungere 810 ml di formaldeide al 37% a 30 ml di sospensione cellulare (concentrazione finale 1%) e incubare a 37 ° C per 5 min. Per le cellule aderenti, correggere direttamente le cellule in coltura con l'aggiunta di 810 ml di formaldeide al 37% a 30 ml di terreno di coltura. Fermare la reticolazione con l'aggiunta di 3,1 ml di 1,25 M soluzione di glicina (concentrazione finale 127 mm), eincubare a temperatura ambiente per 10 min. Raccogliere le cellule per centrifugazione (300 xg per 5 minuti a 4 ° C). Eliminare attentamente il surnatante compresi formaldeide e conservarla in un flacone di scarico adeguato. Per le cellule aderenti, staccare le cellule con un raschietto cellulare e raccolto in un tubo da 50 ml, e raccogliere le cellule, come descritto in questo passaggio. Per gli esperimenti SILAC, mescolare le cellule staccate coltivati ​​in terreno pesante o media luce (5 x 10 7 cellule ciascuno), dividere il totale di 1 x 10 8 cellule in 5 provette contenenti 2 x 10 7 cellule e raccogliere le cellule come descritto in questo passo. Lavare il pellet con 30 ml di PBS due volte per provetta. Eliminare attentamente il surnatante compresi formaldeide e conservarla in uno spreco appropriata bottle.Handle rifiuti formaldeide secondo le linee guida sulla sicurezza chimica. Le cellule fissate possono essere congelati e conservati a -80 ° C. 4. Preparazione di cromatina (per 2 x 107 cellule) Sospendere le cellule fissate in 10 ml di tampone di lisi cellulare (Tris 10 mM (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630, e 1 × inibitori della proteasi) e incubare in ghiaccio per 10 min. Centrifugare il campione (830 × ga 4 ° C per 8 min) e scartare con attenzione il surnatante. Sospendere il pellet in 10 ml di tampone di lisi nucleare (Tris 10 mM (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% sodio desossicolato, 0,5% lauroylsarcosine, e inibitori della proteasi 1x). Incubare in ghiaccio per 10 minuti e vortice ogni 2-3 minuti. Centrifugare il campione (830 × ga 4 ° C per 8 min) e scartare con attenzione il surnatante. Lavare il pellet in 10 ml di PBS. Il pellet (frazione cromatina) può essere conservato a -80 ° C dopo immediatamente congelati in azoto liquido. 5. Sonicazione di cromatina (a 2 x 10 7 cellule) Sospendere la frazione cromatina in 800 ml dimodificato tampone di lisi 3 (10 mM Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, 0,1% sodio desossicolato, 0,1% SDS, e 1x inibitori delle proteasi) e trasferire in una provetta da 1,5 ml. Sonicare la cromatina utilizzando un sonicatore (vedi Materiali) e le seguenti condizioni: Uscita: 3; dovere: 100% (continuo); e il tempo libero. Eseguire 10-18 cicli di sonicazione per 10 sec e raffreddamento in ghiaccio per 20 sec. Per evitare un eccessivo riscaldamento, incubare i campioni in ghiaccio per 2 minuti ogni 5-6 cicli. Per evitare la formazione di schiuma, mantenere la posizione della punta della sonda sonicazione 0,5 cm sopra il fondo della provetta. Centrifugare il campione a (16.000 xg a 4 ° C per 10 min) e trasferire il surnatante in una provetta da 1,5 ml. La cromatina sonicato può essere conservato a -80 ° C dopo immediatamente congelati in azoto liquido. 6. Valutazione di cromatina frammentazione Mescolare 10 ml di cromatina frammentata con 85 ml di acqua distillata. Aggiungere 4 ml5 M di NaCl e incubare a 65 ° CO / N. Aggiungere 1 ml di 10 mg / ml RNasi A e incubare a 37 ° C per 45 min. Aggiungere 2 ml di 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 ml di 1 M Tris (pH 6,8), e 1 ml di 20 mg / ml proteinasi K, e incubare a 45 ° C per 1,5 ore. Separati 10 microlitri del campione mediante elettroforesi in gel di agarosio all'1% che non contiene coloranti colorazione come SYBR Green. Macchia il gel per valutare la distribuzione delle lunghezze della cromatina frammentata. Le condizioni che generano una lunghezza media di 0,5-2 kbp (range di 0,2-4 kb) sono raccomandati. Purificare il DNA da campioni rimanenti mediante estrazione con fenolo-cloroformio o usando un kit di estrazione del DNA (vedi Materiali). Il DNA purificato può essere utilizzato come DNA di ingresso per stimare le rese di analisi enChIP (vedi 8.11). 7. Preparazione di Dynabeads Coniugato con anticorpi (per 2 x 10 7 cellule) Prepare due provette da 1,5 ml, uno per pre-compensazione utilizzando IgG normale mouse e l'altra per l'incubazione con l'anticorpo anti-FLAG Ab. Aggiungere 150 ml di proteine ​​sfere magnetiche G-coniugato (vedi Materiali) ad ogni provetta. Porre i tubi su un supporto magnete e attendere 3 minuti. Scartare il surnatante pipettando. Sospendere le perline in 1 ml di PBS contenente 0,01% Tween-20 (PBS-T). Porre i tubi su un supporto magnetico e attendere per 2 min. Eliminare il surnatante pipettando, e quindi ripetere il passaggio. Sospendere le perline in 1 ml di PBS-T contenente 0,1% BSA. Aggiungere 15 mg di IgG di topo normale o anti-FLAG Ab e ruotare a 4 ° CO / N. Spin down brevemente, quindi posizionare i tubi su un supporto magnete e attendere 3 minuti. Scartare il surnatante pipettando. Sospendere le perline in 1 ml di PBS-T. Invertire più volte campione e spin down brevemente. Porre i tubi su un supporto magnete e attendere per 3 minuti, poi scartare il surnatante pipettando. Ripetere il lavaggioaltre due volte con PBS-T (totale di tre fasi di lavaggio). 8. Immunoprecipitazione della cromatina (a 2 x 10 7 cellule) Mescolare la cromatina frammentata preparato in 5.3) (circa 800 ml) con un quinto del volume (circa 200 ml) di tampone di lisi 3 modificato contenente 5% Triton X-100 (concentrazione finale di 1% Triton X-100). Aggiungere la soluzione cromatina al tubo in cui proteine ​​G-coniugati biglie magnetiche coniugate con IgG normale del mouse sono stati preparati. Ruotare a 4 ° C per 1 ora. Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Trasferire il surnatante nel tubo in cui proteine ​​G-coniugati biglie magnetiche coniugati con anti-FLAG Ab sono stati preparati. Ruotare a 4 ° CO / N. Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Scartare il surnatante pipettando. Sospendere le perline in 1 ml di tampone salino basso (20 mM Tris (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, 1% Triton X-100, 0,1% SDS inibitori della proteasi, e 1x) e ruotare a 4 ° C per 5 min. Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Scartare il surnatante pipettando e ripetere la fase di lavaggio. Lavare le perline con tampone di sali (20 mM Tris (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 500 mM, 1% Triton X-100, 0,1% SDS inibitori della proteasi, e 1x) due volte. Lavare le perline con tampone LiCl (Tris 10 mM (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% sodio desossicolato, e inibitori della proteasi 1x) due volte. Lavare le perline con TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% inibitori IGEPAL CA-630, e 1x proteasi) una volta. Sospendere le perline in 200 ml di tampone di eluizione (Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% IGEPAL CA-630, inibitori della proteasi 1x e 500 mcg / ml 3 × FLAG peptide) e incubare a 37 ° C per 20 min. Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml e ripetere il Elution passo. Purificare DNA da piccola porzione (ad esempio, 5%) dell'eluato mediante estrazione con fenolo-cloroformio o usando un kit di estrazione del DNA (vedi Materiali). Il DNA purificato può essere utilizzato per PCR con primer specifici imposta per stimare le rese di enChIP analisi confrontando con DNA ingresso preparata al punto 6.7 come descritto in precedenza 14,16. 9. SDS-PAGE, colorazione, e analisi spettrometrica di massa Mescolare l'eluato (400 microlitri) con 1 ml di 2-propanolo, 50 ml di 3M acetato di sodio (pH 5,2), e 5 ml di 20 mg / ml di glicogeno. Precipitare la cromatina a -20 ° CO / N. Centrifugare il campione (16.000 xg a 4 ° C per 30 min) e scartare il surnatante. Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare di nuovo (16.000 xg a 4 ° C per 10 min). Eliminare il surnatante completamente pipettando. Sospendere il pellet in 40 ml di tampone 2x campione (125 mM Tris (pH 6,8), il 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% di saccarosio, e 0,004% blu di bromofenolo). Vortex per 5 minuti per sciogliere completamente il pellet, e poi incubare a 100 ° C per 30 minuti per denaturare le proteine ​​e invertire la reticolazione. Per SDS-PAGE, eseguire 40 ml di campione sul gel finché il colorante raggiunge 1 cm sotto il pozzo. Nota: Usiamo solitamente 4-20 gel% di pendenza, ma altri gel% può essere utilizzato. Colorare il gel con Coomassie Brilliant Blue o macchia d'argento. Tagliare il gel in cinque pezzi (2 mm) di altezza. Eseguire la digestione gel e spettrometria di massa come descritto in precedenza 13-16. Per gli esperimenti SILAC con 5 x 10 7 cellule ciascuna (totale di 1 x 10 8 cellule), sospendere pellet dagli iniziali cinque tubi in 40 ml di tampone 2x campione (non è necessario scalare). 10. Purificazione di RNA e l'RNA-Seq Analisi Per purificare l'RNA dopo enChIP, aggiungere 5 U / ml di RNase Inhibitor (seMateriali e) a tutte le soluzioni tampone, tranne modificato lysis buffer 3 e il tampone di eluizione, a cui aggiungere 40 U / ml di RNasi Inhibitor. Mescolare l'eluato (400 ml) con 16 ml di NaCl 5 M e incubare a 65 ° C per 2 ore. Aggiungere 1 ml di reagente acido-guanidinio-base-fenolo (vedi Materiali) al campione. Vortex per 15 secondi e poi incubare a temperatura ambiente per 5-15 min. Centrifugare il campione per 15 minuti a 12.000 xg e RT. Trasferire il surnatante in una nuova provetta 1,5 ml e aggiungere 5 ml di p-bromoanisole. Vortex per 15 secondi e poi incubare a temperatura ambiente per 3-5 minuti. Centrifugare il campione per 10 minuti a 12.000 xg e RT. Trasferire il surnatante (circa 1 ml) in un nuovo tubo 2 ml e aggiungere 1 ml di 2-propanolo. Capovolgere la provetta e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Caricare il composto su una colonna in un kit di purificazione dell'RNA (vedi Materiali). Centrifugare colonna per 1 min a 12.000 × g e RT. lavaggiola colonna con 400 ml di RNA tampone di lavaggio in un kit di purificazione di RNA (vedi Materiali). Aggiungere 80 ml di DNasi I cocktail (miscela di 5 ml di DNasi I (1 U / ml), 8 ml di 10 × DNasi I tampone di reazione, 3 ml di acqua priva di RNasi DNase /, e 64 ml di RNA tampone di lavaggio in un kit di purificazione dell'RNA (vedi Materiali)) per la colonna. Incubare il campione a 37 ° C per 15 minuti, quindi si centrifuga per 30 sec a 12.000 xg e RT. Lavare la colonna con 400 ml di RNA prelavaggio tampone in un kit di purificazione di RNA (vedi Materiali) due volte. Eluire l'RNA con 50 ml di acqua / RNasi-free DNasi. L'RNA eluito può essere utilizzato per il sequenziamento RNA.