Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Toshitsugu Fujita; Hodaka Fujii

doi:10.3791/53478

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biyoloji

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

Published: January 20, 2016

doi:

10.3791/53478

Toshitsugu Fujita¹, Hodaka Fujii¹

¹Chromatin Biochemistry Research Group, Combined Program on Microbiology and Immunology, Research Institute for Microbial Diseases,Osaka University

Özet

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Abstract

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

Introduction

זיהוי של מולקולות הקשורות לאזורים הגנומי ספציפיים של העניין נדרש להבין את מנגנוני רגולציה של פונקציות הגנומי כגון שעתוק ורגולציה אפיגנטיים. למרות כמה טכניקות פותחו לאנליזה ביוכימית של אזורים הגנומי ספציפיים ^1-7, הם לא בשימוש נרחב בשלב זה בגלל הבעיות שלהם הפנימיות כגון יישום מוגבל (למשל, רק ללוקוסים גבוה עותק מספר או לוקוסים עם חזרות) ו נדרשו זמן ומאמצים רבים מדי.

על מנת לבצע את הניתוח ביוכימי של אזורים הגנומי ספציפיים בקלות, פיתחנו שתי טכנולוגיות immunoprecipitation הכרומטין מוקד ספציפי (שבב), כלומר insertional השבב (iChIP) ^8-13 ומהונדס שבב תיווך מולקולת ה- DNA מחייב (enChIP) ^14-17 . בiChIP, מוקד של העניין מתויג על ידי רצפי הכרת החדרה של חלבון קושר DNA אקסוגני כגון לקסא המוקד מבודד לאחר מכן על ידי טיהור זיקה באמצעות החלבון קושר DNA מתויג. מתחמים חוזר palindromic קצר interspaced באופן קבוע בenChIP, מהונדס מולקולות ה- DNA מחייבת, כגון חלבוני אבץ-אצבע, חלבוני שעתוק כמו activator (טל), והתקבץ (CRISPR), משמשים לתייג מוקד של עניין (איור 1). בהמשך לכך, אזור גנומי מבודד על ידי טיהור זיקה של מולקולות ה- DNA מחייבת המתויגות.

אחד היתרונות של enChIP על iChIP הוא שההכנסה של רצפי הכרה של חלבון קושר DNA אקסוגני היא לא הכרחית. המיקוד של לוקוסים באמצעות מתחמי CRISPR בהיקף של צורת catalytically פעילה של Cas9 (dCas9) וRNA מדריך (gRNA) הוא הרבה יותר קל מאשר המיקוד של אזורים אלה על ידי iChIP או enChIP באמצעות חלבוני טל ואבץ-אצבע. כאן, אנו מתארים פרוטוקול צעד-אחר-צעד לenChIP בשילוב עם ספקטרומטריית מסה ורצף RNA (RNA-Seq) לזהות מוקד-associaחלבוני טד וRNAs, בהתאמה.

Protocol

1. עיצוב של מולקולות ה- DNA מחייב תכנון הנדסי הכרת לוקוס היעד לenChIP באמצעות מתחמי CRISPR, להשתמש בכלי CRISPRdirect האינטרנט (http://crispr.dbcls.jp) לזהות רצפי יעד gRNA מועמד באזור הגנומי של עניין כפי שתואר קודם לכן 18. כלי אינטרנט זה מחזיר אתרים הגנומי 23 נ"ב של הטופס 5'-N-20 NGG 3 'בתוך אזור היעד. לסנתז gBlock כולל רצף אמרגן U6 והרצף של 5'-N 20 ב5'-N-20 NGG 3 'משתמש בשירותים מסחריים (ראה איור 2) 19,20. לsubcloning מטרות, כוללים אתרי אנזים ההגבלה מתאימים מחוץ לgBlock. הכנס את gBlock לוקטור מתאים כפי שתואר קודם לכן 16. כמה וקטורי retroviral לgBlocks זמינים (ראה חומרים). לenChIP באמצעות חלבוני טל, לתכנן חלבוני טל הכרת טארגלוקוסי et. צור פלסמידים קידוד חלבוני TAL באמצעות שירותים מסחריים. צור וקטורי ביטוי המכילים חלבוני טל התמזגו עם תג אחד או יותר כגון דגל 3 × כפי שתואר קודם לכן 15. 2. הקמת תאים לניתוח enChIP הגעה 3 × הדגל-dCas9 וgRNA (הליך המבוסס על CRISPR) או 3 × דגל-טל (הליך המבוסס על חלבוני טל) בתאים להיות מנותח כפי שתואר לעיל 14-17. השתמש transfection חולף אם יעילות transfection היא גבוהה. וקטור ביטוי המכיל 3 × הדגל-dCas9 ואמרגן CMV הוא זמין (ראה חומרים). לשקול הקמת transformants היציב בשיטות קונבנציונליות אם יעילות transfection החולפת היא נמוכה. בנוסף לוקטורי retroviral האמורים לgBlock, וקטורי retroviral של 3 × הדגל-dCas9 זמינים (ראה חומרים). <li> אשר את הביטוי של 3xFLAG-dCas9 או חלבון 3xFLAG-טל בתאי transfected על ידי ניתוח immunoblot באמצעות נוגדן אנטי-דגל (AB) כפי שתואר לעיל 14-17. הערה: ביטוי של חלבונים מתויגים אלה גם יכול להיות מאושר על ידי צביעה תאית עם אנטי-דגל-FITC וניתוח FACS הבא. פרוטוקול מכתים תאית ניתן להוריד מאתר הבית שלנו (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html). אשר ביטוי של gRNA על ידי טכניקת RT-PCR סטנדרטי. לזיהוי כמותי של חלבוני אינטראקציה עם האזור הגנומי של עניין, לשקול שימוש בתיוג איזוטופ יציב על ידי חומצות אמינו בתרבית תאים (SILAC) ניתוח בשילוב עם enChIP (enChIP-SILAC). הערה: מדיה לניתוח SILAC ניתן לרכוש מיצרנים מסחריים. SILAC הוא חזק באיתור אינטראקציות ספציפיות. תרבות תאים במדיום כבד SILAC. הכן cultu תאיםאדום במדיום SILAC אור כביקורת שלילית. השתמש לפחות 5 10 × 7 תאים לכל מדיום SILAC (כבד או קל). לתיוג יעיל, מוסיף שני L ליזין-2HCl, 13 C 6 וL- ארגינין-HCl, 13 C 6, 15 N 4 בתקשורת SILAC כבדה. הערה: לפחות חמש חלוקות תא נחוצות לחלבוני תווית. לדוגמא, תאי התרבות אנושיים HT1080 fibrosarcoma יציבות להביע 3xFLAG-dCas9 וgRNA על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בתקשורת DMEM לSILAC וסרום שור העוברי dialyzed עם יזין-2HCl תוספת L- ארגינין-HCl (בינוני אור) או 13 C 6 L ליזין-2HCl בתוספת 13 C 6 15 N 4 L- ארגינין-HCl (בינוני כבד) (ראה חומרים) 16. הוסף 50 מ"ג של אור או L ליזין-2HCl כבד וL- ארגינין-HCl ב500 מיליליטר של מדיום. תאי Trypsinize וreplate לפני שהם הופכים ומחוברות, כך שתאים לשמור growt מעריכיח. 3. Crosslinking של תאים עם פורמלדהיד לתאים בתרבית השעיה, העברה 2 × 10 7 תאים לבטא חלבוני 3xFLAG-טל או 3xFLAG-dCas9 תוספת gRNA ולהשעות ב 30 מיליליטר של מדיום תרבות הקבוע בצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר. כאשר יותר תאים משמשים, להגדיל את הנפחים וכמויות של חומרים כימיים באופן יחסי. לניסויי SILAC, לערבב את התאים בתרבית בינונית כבד או בינוני אור (5 x 10 7 תאים כל אחד) ולחלק את הסכום הכולל של 1 x 10 8 תאים לתוך 5 צינורות המכילים 2 x 10 7 תאים. להוסיף 810 μl של פורמלדהיד 37% עד 30 מיליליטר של ההשעיה התא (ריכוז סופי 1%) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לתאים חסיד, ישירות לתקן תאים בצלחות תרבות על ידי הוספת 810 μl של פורמלדהיד 37% עד 30 מיליליטר של מדיום התרבות. להפסיק crosslinking ידי הוספת 3.1 מיליליטר של 1.25 M פתרון גליצין (ריכוז סופי 127 מ"מ), ולדגור על RT במשך 10 דקות. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה (ז 300 × 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס). להשליך בזהירות פורמלדהיד supernatant כולל ולאחסן אותו בבקבוק פסולת מתאים. לתאים חסיד, לנתק את התאים עם מגרד תא וקציר בצינור מיליליטר 50, ולאסוף תאים כמתואר בשלב זה. לניסויי SILAC, לערבב את התאים בתרבית המנותק בינוני כבד או בינוני אור (5 x 10 7 תאים כל אחד), לחלק את סך של 1 x 10 8 תאים לתוך 5 צינורות המכילים 2 x 10 7 תאים, ולאסוף תאים כפי שמתואר בזה שָׁלָב. שטוף את התא גלולה עם 30 מיליליטר של PBS פעמיים לכל צינור. להשליך בזהירות את supernatant כולל פורמאלדהיד ולאחסן אותו בפסולת מתאימה bottle.Handle פסולת פורמלדהיד פי הנחיות בטיחות כימיות. אפשר להקפיא תאים הקבועים ומאוחסנים ב -80 ° C. 4. הכנת הכרומטין (מחיר 2 x 107 תאים) להשעות את התאים הקבועים ב 10 מיליליטר של חיץ תמוגה תא (10 מ"מ טריס (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5% IGEPAL CA-630, ו1 × מעכבי פרוטאז) ודגירה על קרח למשך 10 דקות. צנטריפוגה המדגם (ז × 830 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות) וזורקים supernatant בזהירות. להשעות את גלולה ב 10 מיליליטר של חיץ תמוגה הגרעיני (10 מ"מ טריס (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% deoxycholate נתרן, lauroylsarcosine 0.5%, ומעכבי פרוטאז 1x). דגירה על קרח למשך 10 דקות ומערבולת כל דקות 2-3. צנטריפוגה המדגם (830 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות) וזורקים supernatant בזהירות. שטוף את הכדור ב 10 מיליליטר של PBS. גלולה (חלק הכרומטין) ניתן לאחסן ב -80 ° C לאחר הקפאה מיידית בחנקן נוזלי. 5. Sonication של הכרומטין (מחיר 2 x 10 7 תאים) להשעות את חלק הכרומטין ב800 μl שלתמוגה חיץ שונה 3 (10 מעכבי פרוטאז מ"מ טריס (pH 8.0), 1 mM EDTA, 150 מ"מ NaCl, 0.1% deoxycholate נתרן, 0.1% SDS, ו1x) ולהעביר לתוך צינור 1.5 מיליליטר. Sonicate הכרומטין באמצעות sonicator (ראה חומרים) והתנאים הבאים: פלט: 3; החובה: 100% (רציפה); וזמן: ללא תשלום. לבצע 10-18 מחזורים של sonication במשך 10 שניות וקירור בקרח במשך 20 שניות. כדי להימנע מחימום יתר, דגירה על דגימות קרח למשך 2 דקות כל 5-6 מחזורים. כדי למנוע הקצפה, לשמור על העמדה של הקצה של חללית sonication 0.5 סנטימטרים מעל החלק התחתון של הצינור. צנטריפוגה המדגם ב( ז × 16,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות) ולהעביר את supernatant לתוך צינור 1.5 מיליליטר. הכרומטין sonicated ניתן לאחסן ב -80 ° C לאחר הקפאה מיידית בחנקן נוזלי. 6. הערכה של פיצול הכרומטין מערבבים 10 μl של הכרומטין המקוטע עם 85 μl של מים מזוקקים. הוסף 4 μl5 M NaCl ולדגור על 65 מעלות CO / N. הוסף 1 μl של 10 מ"ג / מיליליטר RNase ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. הוסף 2 μl 0.5 M EDTA (pH 8.0), 4 μl של 1 M טריס (pH 6.8), וμl 1 של 20 מ"ג / מיליליטר proteinase K, ולאחר מכן לדגור על 45 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות. נפרד 10 μl של המדגם על ידי אלקטרופורזה בג'ל agarose 1% שאינו מכיל צבעים מכתימים כמו SYBR ירוק. כתם ג'ל להעריך את חלוקת האורכים של הכרומטין המקוטע. תנאים שיוצרים אורך ממוצע של 0.5-2 KBP (טווח של .2-4 KBP) מומלצים. לטהר DNA מהדגימות שנותרו על ידי מיצוי פנול, כלורופורם או באמצעות ערכת חילוץ DNA (ראה חומרים). ה- DNA המטוהר יכול לשמש כDNA קלט להעריך את התשואות של ניתוחי enChIP (ראה 8.11). 7. הכנת Dynabeads Conjugated עם נוגדנים (מחיר 2 x 10 7 תאים) מִרֹאשׁלקלף שני צינורות 1.5 מיליליטר, אחד לטרום סליקה באמצעות IgG עכבר הרגיל והשני לדגירה עם אנטי-דגל Ab. להוסיף 150 μl של חרוזים מגנטיים G-מצומדות חלבון (ראה חומרים) על צינור אחד. מניחים את הצינורות על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות. בטל supernatant ידי pipetting. להשעות את החרוזים 1 מיליליטר של PBS המכיל 0.01% Tween-20 (PBS-T). מניחים את הצינורות על דוכן מגנטי ולחכות 2 דקות. בטל supernatant ידי pipetting, ולאחר מכן לחזור על הצעד. להשעות את החרוזים 1 מיליליטר של PBS-T המכיל BSA 0.1%. הוסף 15 מיקרוגרם של IgG עכבר הרגיל או אנטי-הדגל Ab ולסובב על 4 מעלות CO / N. ספין למטה בקצרה, ואז למקם את הצינורות על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות. בטל supernatant ידי pipetting. להשעות את החרוזים 1 מיליליטר של PBS-T. הפוך את המדגם מספר פעמים וספין למטה בקצרה. מניחים את הצינורות על דוכן מגנט ולהמתין 3 דקות, ואז להשליך את supernatant ידי pipetting. חזור על לשטוףעוד פעמיים עם PBS-T (כולל של שלושה שלבים לשטוף). 8. הכרומטין immunoprecipitation (מחיר 2 x 10 7 תאים) מערבבים את הכרומטין המקוטע הערוך 5.3) (כ -800 μl) עם חמישית מהנפח (כ -200 μl) של תמוגה חיץ שונה 3 המכיל 5% Triton X-100 (ריכוז סופי של 1% Triton X-100). מוסיף את פתרון הכרומטין לצינור שבו חרוזים מגנטיים חלבון G-מצומדות מצומדות עם העכבר רגיל IgG הוכנו. סיבוב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. מניחים את הצינור על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות. מעבירים את supernatant לתוך הצינור שבו חרוזים מגנטיים חלבון G-מצומדות מצומדות עם אנטי-הדגל Ab הוכנו. סיבוב על 4 מעלות CO / N. מניחים את הצינור על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות. בטל supernatant ידי pipetting. להשעות את החרוזים 1 מיליליטר של חיץ נמוך מלח (20 מ"מ טריס (pH 8.0), 2 מ"מ EDTA, 150 מ"מ NaCl, 1% TriX-100 טון, מעכבי פרוטאז 0.1% SDS, ו1x) ולסובב על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מניחים את הצינור על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות. בטל supernatant ידי pipetting וחזור על השלב לשטוף. שטוף את החרוזים עם חיץ מלח גבוה (20 מ"מ טריס (pH 8.0), 2 מ"מ EDTA, 500 מ"מ NaCl, 1% Triton X-100, מעכבי פרוטאז 0.1% SDS, ו1x) פעמיים. שטוף את החרוזים עם חיץ LiCl (10 מ"מ טריס (pH 8.0), 1 mM EDTA, 250 מ"מ LiCl, 0.5% IGEPAL CA-630, 0.5% deoxycholate נתרן, ומעכבי פרוטאז 1x) פעמיים. שטוף את החרוזים עם TBS-IGEPAL CA-630 (50 מ"מ טריס (pH 7.5), 150 מ"מ NaCl, מעכבי CA-630 IGEPAL, ופרוטאז 1x 0.1%) פעם אחת. להשעות את החרוזים 200 μl של חיץ elution (50 מ"מ טריס (pH 7.5), 150 מ"מ NaCl, 0.1% CA-630 IGEPAL, מעכבי פרוטאז 1x, ו -500 מיקרוגרם / מיליליטר 3 פפטיד × FLAG) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. מניחים את הצינור על דוכן מגנט ולחכות 3 דקות. מעבירים את supernatant לתוך צינור 1.5 מיליליטר חדש ולחזור על elutצעד יון. לטהר DNA מחלק קטן (למשל, 5%) של eluate ידי מיצוי פנול, כלורופורם או באמצעות ערכת חילוץ DNA (ראה חומרים). ה- DNA המטוהר יכול לשמש לPCR עם פריימר הספציפי קובע להעריך את התשואות של enChIP ניתוחים על ידי השוואה עם קלט DNA מוכן בשלב 6.7 כפי שתואר לעיל 14,16. 9. SDS-PAGE, מכתים, וניתוח ההמוני spectrometric מערבבים את eluate (400 μl) עם 1 מיליליטר של 2-propanol, 50 μl של נתרן אצטט 3M (pH 5.2), ו -5 μl של 20 מ"ג / מיליליטר גליקוגן. לזרז את הכרומטין בCO -20 ° / N. צנטריפוגה המדגם (ז × 16,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות) וזורקים supernatant. יש לשטוף את הכדור עם 1 מיליליטר של 70% אתנול ו צנטריפוגות שוב (ז 16,000 × ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות). בטל supernatant לחלוטין על ידי pipetting. להשעות את גלולה ב -40 μl של חיץ מדגם 2x (125 מ"מ טריס (pH 6.8), 10% 2-מרצדסaptoethanol, 4% SDS, 10% סוכרוז, ו0.004% bromophenol כחול). וורטקס למשך 5 דקות לפזר את גלולה לחלוטין, ולאחר מכן לדגור על 100 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לפגל את החלבונים ולהפוך את crosslinking. לSDS-PAGE, לרוץ 40 μl של המדגם על הג'ל עד לצבוע מגיע 1 סנטימטר מתחת היטב. הערה: אנו משתמשים בדרך כלל 4-20 ג'לי שיפוע%, אך ניתן להשתמש ג'לי% אחר. כתם ג'ל עם כחול מבריק Coomassie או כתם כסף. חותך את הג'ל לתוך חמש חתיכות (2 גובה מ"מ). לבצע בעיכול ג'ל וניתוח ספקטרומטריה כפי שתואר לעיל 13-16. לניסויי SILAC עם 5 x 10 7 תאים כל אחד (סך של 1 x 10 8 תאים), להשעות גלולה מחמישה צינורות הראשוניים ב -40 μl של חיץ מדגם 2x (אין צורך בהיקף של עד). 10. טיהור של ניתוח RNA ו- RNA-Seq לטהר RNA לאחר enChIP, להוסיף 5 U / ml של RNase אינהיביטור (SEדואר חומרים) לכל פתרונות החיץ, למעט תמוגה חיץ שונה 3 וחיץ elution, ולכך יש להוסיף 40 U / ml של RNase מונעי. מערבבים את eluate (400 μl) עם 16 μl של 5 M NaCl ולדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. הוסף 1 מיליליטר של מגיב החומצה-guanidinium-מבוסס פנול (ראה חומרים) לדוגמא. וורטקס במשך 15 שניות ולאחר מכן לדגור על RT במשך 5-15 דקות. צנטריפוגה המדגם במשך 15 דקות בגרם 12,000 × וRT. מעבירים את supernatant לצינור 1.5 מיליליטר חדש ולהוסיף 5 μl של p-bromoanisole. וורטקס במשך 15 שניות ולאחר מכן לדגור על RT במשך 3-5 דקות. צנטריפוגה המדגם של 10 דקות ב g 12,000 × וRT. מעבירים את supernatant (כ 1 מיליליטר) לתוך צינור 2 מיליליטר חדש ולהוסיף 1 מיליליטר של 2-propanol. להפוך את הצינור ולדגור על RT במשך 10 דקות. טען את התערובת על עמודה בערכת טיהור RNA (ראה חומרים). צנטריפוגה עמודת דקות 1 ב 12,000 × ז וRT. לִשְׁטוֹףהטור עם 400 μl של רנ"א הצפת לשטוף בערכת טיהור RNA (ראה חומרים). להוסיף 80 μl של DNase אני קוקטייל (תערובת של 5 μl של DNase אני (1 U / μl), 8 μl 10 × DNase אני הצפת תגובה, 3 μl מים RNase ללא DNase /, ו -64 μl של רנ"א הצפת לשטוף ב ערכת טיהור RNA (ראה חומרים)) לעמודה. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ואז צנטריפוגות במשך 30 שניות ב12,000 × g וRT. לשטוף את העמודה עם 400 μl של רנ"א כביסה מוקדמת הצפת בערכת טיהור RNA (ראה חומרים) פעמיים. Elute RNA עם 50 μl של DNase / מים RNase ללא. RNA eluted יכול לשמש לקביעת רצף RNA.

Representative Results

בסך הכל, 1-30% מאזורים הגנומי היעד יכולים להיות מטוהרים באמצעות enChIP. איור 3 כוללים נתונים נציג המציגים את התשואות של enChIP ניתוחי מיקוד הטלומרים והאמרגן של אינטרפרון הגן (IFN) גורם-1 רגולציה (IRF-1). כדוגמאות לתוצאות טיפוסיות, טבלה 1 רשימות החלבונים הקשורים לאמרגן IRF-1 באופן IFNγ ספציפי זוהה על ידי enChIP-SILAC, טבלה 2 רשימות מחייבים חלבוני הטלומרים זוהו על ידי enChIP בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (enChIP-MS) , ולוח 3 רשימות RNAs קשורים עם הטלומרים זוהו על ידי enChIP-רנ"א-Seq. איור 1. סקירה כללית של enChIP. CRISPR באמצעות enChIP (A, B) וטל (C, D, E </strong>) מוצג. מוקד העניין מתויג עם מולקולות ה- DNA מחייבת מהונדסות כגון מערכת CRISPR בהיקף של צורת catalytically פעילה של Cas9 (dCas) חלבון או טל ולהדריך RNA (gRNA). האינטראקציות מולקולריות קבועות עם פורמלדהיד או crosslinkers אחר, במידת צורך. בהמשך לכך, הכרומטין קבוע מקוטע על ידי sonication או עיכול אנזימטי. האזורים הגנומי מתויגים הם מטוהרים על ידי טיהור זיקה. לבסוף, crosslinking מתהפך, ומולקולות אינטראקציה (אזורים הגנומי, RNAs, וחלבונים) מזוהות באמצעות רצף של הדור הבא וספקטרומטר מסה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. רצף של gBlock. אמרגן U6 (בשחור), ב נוקלאוטיד Gefore רצף המדריך (בכחול), רצף המדריך (spacer gRNA) (באדום), רצף הפיגום (בירוק), ורצף שליחות קטלנית (בכתום) מוצגים. איור 3. תשואות של enChIP נציג ניתוחים. אחוז () תשומות ליעד לוקוס IRF-1 ומוקד Sox2 היעד הלא. אחוז (ב) תשומות להטלומרים היעד וγ-לווינים שאינם יעד. הנתונים הותאמו ושונים מפרסומים קודמים 15,16. קטגוריות חלבונים תַעֲתוּק DDX1, PARP1, CKAP4, הומולוג Pescadillo, PURβ, פולימראז מופעל RNA השני P15 activator תעתיק, BTF3, Myb מחייב1A חלבון deacetylation היסטון, רכיבי corepressor RBBP4, PA2G4, TBL3 Acetyltransferase N-methyltransferase ארגינין חלבון 1 topoisomerase DNA 2α topoisomerase DNA ההיסטונים היסטון H2A.Z, H3.2 היסטון טבלת 1:. דוגמאות לחלבונים הקשורים לאזור האמרגן IRF-1 האנושי באופן IFNγ ספציפי זוהה על ידי enChIP-SILAC השולחן הותאם מפרסום קודם 16. קטגוריות חלבונים מחייבים חלבוני הטלומרים יונקים PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 הטלומרים-דוחלבוני nding בשמרים או אורגניזמים אחרים IMP4 חלבוני אינטראקציה עם הטלומרים מחייבים חלבונים [חלבון קושר הטלומרים קשורים] DNA פולימראז α [Cdc13p] (POLA1), ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FOXP2-POT1], exportin-5 [טרט], GNL3L [TRF1], exportin-1 [טרט], 14-3-3 [טרט] חלבוני לוקליזציה לheterochromatin BEND3 חלבונים המסדירים סימנים אפיגנטיים KDM5C חלבוני מוטציות שמשפיעים על תפקוד הטלומרים α DNA פולימרז (POLA1), HAT1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, גלוטמט-ציסטאין האנזים, מסוג glutaredoxin, SMRC1 טבלה 2:. דוגמאות לחלבונים הקשורים עם הטלומרים עכבר זוהו על ידי enChIP-MS השולחן הייתה adapteד מפרסום קודם 15. קטגוריות RNAs רכיבי טלומרז Terc, Rmrp Telomeric RNAs טראס scaRNAs Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 H / ACA snoRNAs Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a C / D snoRNAs Snord17, Snord15a, Snord118 lncRNA Neat1 לוח 3: דוגמאות לRNAs קשורים עם הטלומרים עכבר זוהו על ידי enChIP-רנ"א-Seq השולחן הותאם מפרסום קודם 17..

Discussion

Here, we describe the purification of specific genomic regions using engineered DNA-binding molecules such as the CRISPR system and TAL proteins, and the identification of proteins and RNAs bound to these genomic regions. Binding of engineered DNA-binding molecules to the genome may affect chromatin structure, including nucleosome positioning, and may abrogate genomic functions, as described in CRISPR interference experiments²¹. To avoid these potential aberrant effects, we propose specific guidelines for choosing target genomic regions. First, to avoid potential inhibition of the recruitment of RNA polymerases and transcription factors, as well as disruption of nucleosome positioning around the transcription start site, the target regions for analyses of promoter regions should be several hundred base pairs upstream of (5′ to) the transcription start site. By contrast, when analyzing genomic regions with distinct boundaries, such as enhancers and silencers, genomic regions that are directly juxtaposed to these regions can be targeted because it is less likely that the binding of engineered DNA-binding molecules will affect their functions. Furthermore, it is best to avoid using target regions that are conserved among different species, because important DNA-binding molecules often bind to evolutionarily conserved regions and inhibition of their binding might disrupt the functions of the target genomic regions. In this regard, it is always necessary to check that the function of the target genomic region is maintained in the established cells used for enChIP analyses. Because multiple gRNAs can be tested easily and it is tedious and expensive to generate multiple versions of TAL or zinc-finger proteins recognizing different target genomic regions, enChIP using CRISPR is more advantageous than enChIP using other proteins.

It has been shown that dCas9 binds to off-target sites although affinity to those sites might be weaker than that to the target sites^22-25. There are several ways to manage contamination of molecules bound to those off-target sites. First, the use of several, at least two, different gRNAs would be recommended. Those molecules commonly observed in enChIP using distinct gRNAs would be true positives. Second, comparison of different conditions for enChIP would be effective in cancelling contamination of non-specific molecules and molecules bound to off-target sites. Examples of those comparison sets would be (i) stimulation (-) and (+), or (ii) different cell types such as T cells vs. B cells. Finally, quantitative analysis of binding of candidate molecules should be performed to confirm their specific binding to the target sites. It is preferable to prepare cells expressing only dCas9 but not gRNA as a negative control.

Using enChIP analyses, we were able to successfully identify a number of known and novel molecules interacting with specific genomic regions (Tables 1-3)^14-17. However, this technique failed to detect some other known proteins interacting with these regions. For example, STAT1 reportedly associates with the IRF-1 promoter upon IFNγ stimulation⁸, but our enChIP-SILAC analysis did not detect STAT1 as a protein induced to interact with this genomic region¹⁶. In addition, in the enChIP-MS analysis of telomeres, we did not detect shelterin proteins consisting of TRF-1 and TRF-2¹⁵, which have been shown to interact with telomeres²⁶. There are a few potential reasons for these discrepancies. First, the stoichiometry of binding of Stat1 to the IRF-1 promoter might be very low. It is reasonable that enChIP-MS, including enChIP-SILAC, detects proteins that are more abundantly associated with target genomic regions; hence, the analysis of more cells might be necessary to detect these proteins. Increases in the sensitivities of MS instruments would also contribute to the efficient detection of proteins with low stoichiometric binding. Second, some proteins, possibly including Stat1 and shelterins, might be difficult targets for MS analyses. Third, in our analysis of telomere-binding proteins¹⁵, the 3×FLAG-TAL proteins recognizing telomeres (3×FN-Tel-TAL) might have blocked the binding of shelterins to telomeres in a competitive fashion.

In contrast to the relative difficulty of detecting transcription factors binding to specific genomic regions using enChIP, we successfully identified epigenetic regulators such as histone modification enzymes using enChIP analyses. The success of this technique may be due to the fact that epigenetic regulators bind to a broad range of genomic regions; hence, more proteins per genomic region are available for MS. Because epigenetic regulators are increasingly recognized as important targets for drugs against intractable diseases such as cancer, enChIP would be a useful tool for the identification of epigenetic drug targets.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי קרן מדע טאקדה (TF); זכוכית קרן אסאהי; קרן Uehara הזיכרון (HF); Kurata זיכרון Hitachi מדע וטכנולוגית קרן (TF וHF); גרנט ב- סיוע למדענים צעירים (B) (# 25,830,131), גרנט ב- סיוע למחקר מדעי (ג) (# 15K06895) (TF); וגרנט ב- סיוע, גרנט ב- סיוע למחקר מדעי (ב) (# 15H04329), גרנט ב- סיוע למחקר גישוש (למחקר מדעי על "מחזור תמלול 'תחומי חדשניים (# 25,118,512 & # 15H01354) # 26650059) ו'הגנום תמיכה '(# 221S0002) (HF) ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן.

Materials

gBlock synthesis service	Life Technologies	Gene Synthesis by GeneArt
gBlock synthesis service	IDT (Integrated DNA Technologies)	gBlocks Gene Fragments
pSIR-neo	Addgene	51128
pSIR-GFP	Addgene	51134
pSIR-DsRed-Express2	Addgene	51135
pSIR-hCD2	Addgene	51143
TAL synthesis service	Life Technologies	GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1	Addgene	47948
3×FLAG-dCas9/pMXs-puro	Addgene	51240
3×FLAG-dCas9/pMXs-IG	Addgene	51258
3×FLAG-dCas9/pMXs-I2	Addgene	51259
3×FLAG-dCas9/pMXs-neo	Addgene	51260
anti-FLAG M2 Ab	Sigma-Aldrich	F1804
FITC-conjugated anti-FLAG M2	Sigma-Aldrich	F4049
DMEM medium for SILAC	Life Technologies	89985	Other medium can be purchased from Life Technologies
Dialyzed FBS for SILAC	Life Technologies	89986
L-Lysine-2HCl for SILAC	Life Technologies	89987	for Light medium
L-Arginine-HCl for SILAC	Life Technologies	89989	for Light medium
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC	Life Technologies	89988	For Heavy medium
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC	Life Technologies	89990	For Heavy medium
Complete, mini, EDTA-free	Roche Diagnostics	4693159
Ultrasonic Disruptor UD-201	Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D5205
Dynabeads-Protein G	Life Technologies	DB10004
RNasin Plus RNase Inhibitor	Promega	N2611
Isogen II	Nippon Gene	311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2050
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific		a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
nanoLC	Advance, Michrom Bioresources		a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
HTC-PAL autosampler	CTC Analytics		a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis

Referanslar

Zhang, X. Y., Horz, W. Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse. Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).
Workman, J. L., Langmore, J. P. Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin. Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).
Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).
Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. Purification and initial characterization of primate satellite chromatin. Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).
Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).
Ghirlando, R., Felsenfeld, G. Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn. J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).
Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
Hoshino, A., Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).
Fujita, T., Fujii, H. Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One. 6, e26109 (2011).
Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).
Fujita, T., Fujii, H. Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation. ISRN Biochem. 2013, 913273 (2013).
Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins. BMC Mol. Biol. 15, 26 (2014).
Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells. PLoS One. 10, (2015).
Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).
Fujita, T., et al. Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP). Sci. Rep. 3, 3171 (2013).
Fujita, T., Fujii, H. Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR. PLoS One. 9, e103084 (2014).
Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing. PLoS One. 10, e0123387 (2015).
Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Biyoinformatik. , (2014).
Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).
Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).
Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).
Cencic, R., et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. PLoS One. 9, 109213 (2014).
O’Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture. Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).
de Lange, T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).

Etiketler

EnChIP Genomic Region Isolation Molecular Interactions Transcription Epigenetic Regulation DNA-binding Molecules FLAG-dCas9 FLAG-TAL Cross-linking Formaldehyde Glycine Chromatin Extraction Lysis Buffer Nuclear Lysis Buffer

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Fujita, T., Fujii, H. Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP. J. Vis. Exp. (107), e53478, doi:10.3791/53478 (2016).