Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Toshitsugu Fujita; Hodaka Fujii

doi:10.3791/53478

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Biyoloji

Isolement des régions génomiques spécifiques et l'identification des molécules associées par enChIP

Published: January 20, 2016

doi:

10.3791/53478

Toshitsugu Fujita¹, Hodaka Fujii¹

¹Chromatin Biochemistry Research Group, Combined Program on Microbiology and Immunology, Research Institute for Microbial Diseases,Osaka University

Özet

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Abstract

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

Introduction

L'identification des molécules associées à des régions génomiques spécifiques d'intérêt est nécessaire pour comprendre les mécanismes de régulation des fonctions génomiques telles que la transcription et la régulation épigénétique. Bien que plusieurs techniques ont été développées pour l'analyse biochimique de régions génomiques spécifiques ^1-7, ils ne sont pas largement utilisés à ce stade en raison de leurs problèmes intrinsèques telles que l'application limitée (par exemple, seulement pour nombre élevé de copies loci ou loci avec des répétitions) et trop de temps et les efforts nécessaires.

Afin d'effectuer une analyse biochimique de régions génomiques spécifiques facilement, nous avons développé deux (Chip) technologies spécifiques locus chromatine immunoprécipitation, à savoir insertion puce ^(8-13) iChip et ingénierie liaison à l'ADN puce molécule médiation (enChIP) ^14-17 . Dans iChip, un locus d'intérêt est marqué par l'insertion des séquences de reconnaissance d'une protéine de liaison d'ADN exogène, tels que LexA. Le locus est ensuite isolé par purification d'affinité en utilisant la protéine de liaison d'ADN marqués. Dans enChIP, ingénierie des molécules de liaison à l'ADN, telles que les protéines en doigt de zinc, protéines (TAL) transcription activateur-like, et en grappes répétitions palindromiques courts régulièrement espacées (CRISPR) complexes, sont utilisés pour marquer un lieu d'intérêt (Figure 1). Par la suite, la région génomique est isolé par purification par affinité des molécules de liaison à l'ADN marquées.

L'un des avantages de enChIP sur iChip est que l'insertion de séquences de reconnaissance d'une protéine liant l'ADN exogène est pas nécessaire. Le ciblage des loci CRISPR utilisant des complexes constitués d'une forme d'activité catalytique de cas9 (dCas9) et un ARN de guidage (ARNg) est beaucoup plus facile que de cibler de ces régions par iChip ou enChIP utilisant des protéines Tal et à doigts de zinc. Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour enChIP couplée à la spectrométrie de masse et séquençage de l'ARN (ARN-Seq) pour identifier les locus associales protéines et les ARN Ted, respectivement.

Protocol

1. Conception de molécules Engineered liaison à l'ADN Reconnaissant le Locus cible Pour enChIP utilisant des complexes CRISPR, utilisez l'outil Web de CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) pour identifier des séquences cibles ARNg candidat dans la région génomique d'intérêt, comme décrit précédemment 18. Cet outil Web renvoie 23 pb des sites génomiques de la forme 5'-N 20 NGG-3 'dans la région cible. Synthétiser un gBlock comprenant la séquence de promoteur U6 et de la séquence 5'-N 20 en 5'-N 20 NGG-3 'en utilisant les services commerciaux (voir la figure 2) 19,20. À des fins de sous-clonage, inclure des sites d'enzymes de restriction appropriés à l'extérieur de la gBlock. Insérez le gBlock dans un vecteur approprié comme décrit précédemment 16. Plusieurs vecteurs rétroviraux pour gBlocks sont disponibles (voir Matériaux). Pour enChIP utilisant des protéines TAL, concevoir des protéines TAL reconnaissant le target loci. Générer des plasmides codant pour des protéines TAL utilisant les services commerciaux. Générer des vecteurs d'expression contenant les protéines TAL condensés avec un ou plusieurs mots-clés tels que FLAG 3 × 15 comme décrit précédemment. 2. Mise en place de cellules pour l'analyse des enChIP Exprimez 3 × FLAG-dCas9 et ARNg (procédure basée CRISPR-) ou 3 × FLAG-TAL (TAL procédure à base de protéines) dans les cellules pour être analysé comme décrit précédemment 14-17. Utilisez transfection transitoire si l'efficacité de la transfection est élevé. Un vecteur d'expression contenant 3 × FLAG-dCas9 et le promoteur CMV est disponible (voir Matériaux). Envisager de créer des transformants stables en utilisant des méthodes conventionnelles si l'efficacité de transfection transitoire est faible. En plus des vecteurs de retrovirus mentionnés ci-dessus pour gBlock, des vecteurs rétroviraux de 3 × FLAG-dCas9 sont disponibles (voir Matériaux). <li> Confirmation de l'expression du 3xFLAG-dCas9 ou protéine 3xFLAG-TAL dans les cellules transfectées par analyse par immunotransfert en utilisant un anticorps anti-FLAG (Ab) 14 à 17 comme décrit précédemment. Note: L'expression de ces protéines marquées peuvent également être confirmée par coloration intracellulaire avec anti-FLAG-FITC et une analyse FACS ultérieure. Un protocole pour la coloration intracellulaire peut être téléchargé à partir de notre page d'accueil (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html). Confirmez expression de la ARNg par la technique RT-PCR standard. Pour l'identification quantitative des protéines interagissant avec la région génomique d'intérêt, envisager l'utilisation d'un marquage isotopique stable par les acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) d'analyse combiné avec enChIP (enChIP-SILAC). Remarque: Le support pour l'analyse de SILAC peuvent être achetés auprès de fournisseurs commerciaux. SILAC est puissante dans la détection des interactions spécifiques. Les cellules de la culture dans SILAC milieu lourd. Préparer des cellules culturouge dans le milieu de la lumière de SILAC comme contrôle négatif. Utilisez au moins 5 × 10 7 cellules pour chaque moyen de SILAC (lourd ou léger). Pour un marquage efficace, ajoutez les deux L-lysine-2HCl, 13 C 6 et L-arginine-HCl, 13 C 6, 15 N 4 dans les médias SILAC lourds. Remarque: Au moins cinq divisions cellulaires sont nécessaires pour les protéines de l'étiquette. Par exemple, la culture de cellules de fibrosarcome HT1080 humaines exprimant de manière stable 3xFLAG-dCas9 et un ARNg à 37 ° C et 5% de CO 2 dans des milieux DMEM pendant SILAC et sérum dialyse de fœtus bovin avec Lysine-2HCl ainsi que la L-arginine-HCl (milieu de lumière) ou 13 C 6 L-lysine-2HCl plus 13 C 6 15 N 4 L-arginine-HCl (milieu lourd) (voir Matériaux) 16. Ajouter 50 mg de léger ou lourd de L-lysine 2HCI et L-arginine-HCl dans 500 ml de milieu. Cellules Trypsiniser et replate avant qu'ils ne deviennent confluentes sorte que les cellules conservent growt exponentielleh. 3. La réticulation des cellules avec du formaldéhyde Pour les cellules en culture en suspension, le transfert de 2 × 10 7 cellules exprimant des protéines 3xFLAG-Tal ou 3xFLAG-dCas9 ainsi ARNg et suspendre dans 30 ml de milieu de culture régulière dans un tube de 50 ml de la centrifugeuse. Lorsque plusieurs cellules sont utilisées, augmenter les volumes et quantités de réactifs proportionnellement. Pour les expériences de SILAC, mélanger les cellules cultivées dans un milieu lourd ou moyen de lumière (5 x 10 7 cellules chacun) et diviser le total de 1 x 10 8 cellules dans 5 tubes contenant 2 x 10 7 cellules. Ajouter 810 ul de formaldehyde à 37% à 30 ml de la suspension de cellules (concentration finale 1%) et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Pour les cellules adhérentes, fixer directement les cellules dans des boîtes de culture en ajoutant 810 ul de 37% de formaldéhyde à 30 ml de milieu de culture. Arrêter la reticulation par addition de 3,1 ml de 1,25 M une solution de glycine (concentration finale 127 mM), etincuber à température ambiante pendant 10 min. Recueillir les cellules par centrifugation (300 g pendant 5 min à 4 ° C). Prenez soin de le surnageant dont le formaldéhyde et le stocker dans un flacon de récupération approprié. Pour les cellules adhérentes, détacher les cellules avec un grattoir à cellules et la récolte dans un tube de 50 ml, et de recueillir des cellules de la manière décrite dans cette étape. Pour les expériences de SILAC, mélanger les cellules individuelles cultivées dans un milieu lourd ou moyen de lumière (5 x 10 7 cellules chacun), diviser le total de 1 x 10 8 cellules dans 5 tubes contenant 2 x 10 7 cellules, et de recueillir des cellules telles que décrites dans le présent marche. Laver le culot cellulaire avec 30 ml de PBS deux fois par tube. Prenez soin de le surnageant dont le formaldéhyde et le stocker dans un déchets approprié bottle.Handle les déchets de formaldéhyde conformément aux lignes directrices de la sécurité chimique. Les cellules fixées peuvent être congelés et conservés à -80 ° C. 4. Préparation de la chromatine (par 2 x 107 cellules) Suspendre les cellules fixées dans 10 ml de tampon de lyse cellulaire (10 mM de Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, 0,5% de IGEPAL CA-630 et 1 x inhibiteurs de protease) et laisser incuber sur de la glace pendant 10 min. Centrifugeuse l'échantillon (830 g à 4 ° C pendant 8 min) et jeter le surnageant avec précaution. Suspendre le culot dans 10 ml de tampon de lyse nucléaire (Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M, 1% de Triton X-100, le désoxycholate à 0,5% de sodium, 0,5% de lauroylsarcosine, et les inhibiteurs de protéase 1x). Incuber sur de la glace pendant 10 min et vortex toutes les 2-3 min. Centrifuger l'échantillon (830 × g à 4 ° C pendant 8 min) et jeter le surnageant avec précaution. Laver le culot dans 10 ml de PBS. Le culot (fraction de la chromatine) peut être stocké à -80 ° C après congélation immédiate dans de l'azote liquide. 5. Le traitement par ultrasons de la chromatine (par 2 x 10 7 cellules) Suspendre la fraction de la chromatine dans 800 pi detampon de lyse 3 modifié (mM de Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, désoxycholate de sodium à 0,1%, 0,1% SDS, et 10 1x inhibiteurs de protease) et transférer dans un tube de 1,5 ml. Soniquer la chromatine en utilisant un appareil à ultrasons (voir Matériaux) et les conditions suivantes: Sortie: 3; devoir: 100% (en continu); et l'heure: gratuit. Effectuer 10-18 cycles de traitement par ultrasons pendant 10 secondes et le refroidissement sur de la glace pendant 20 sec. Pour éviter un échauffement excessif, incuber les échantillons sur la glace pendant 2 min tous les 5-6 cycles. Pour éviter la formation de mousse, garder la position de la pointe de la sonde ultrasons 0,5 cm au-dessus du fond du tube. Centrifuger l'échantillon à (16 000 xg à 4 ° C pendant 10 min) et le surnageant transférer dans un tube de 1,5 ml. La chromatine traitée aux ultrasons peut être conservé à -80 ° C après congélation immédiate dans de l'azote liquide. 6. Évaluation de la chromatine fragmentation Mélanger 10 pi de la chromatine fragmentée avec 85 pi d'eau distillée. Ajouter 4 pi5 M de NaCl et incuber à 65 ° CO / N. Ajouter 1 pi de 10 mg / ml de RNase A et incuber à 37 ° C pendant 45 min. Ajouter 2 ul d'EDTA 0,5 M (pH 8,0), 4 pi de Tris 1 M (pH 6,8) et 1 ul de 20 mg / ml de proteinase K, puis incuber à 45 ° C pendant 1,5 heure. Séparer 10 ul de l'échantillon par électrophorèse dans un gel d'agarose à 1% qui ne contient pas de coloration tels que des colorants SYBR Green. Colorer le gel à évaluer la distribution des longueurs de la chromatine fragmentée. Conditions qui génèrent une longueur moyenne de 0,5-2 kpb (gamme de 0,2-4 kb) sont recommandés. On purifie l'ADN à partir des échantillons restants par extraction au phénol-chloroforme ou en utilisant un kit d'extraction d'ADN (voir Matériaux). L'ADN purifié peut être utilisé comme ADN d'entrée pour estimer les rendements des analyses de enChIP (voir 8.11). 7. Préparation des Dynabeads conjugués avec des anticorps (par 2 x 10 7 cellules) Prérogner deux tubes de 1,5 ml, pour une pré-compensation en utilisant IgG de souris normale et l'autre pour l'incubation avec l'anticorps anti-FLAG Ab. Ajouter 150 pi de billes de protéine G-magnétiques conjugué (voir Matériaux) à chaque tube. Placer les tubes sur un support magnétique et attendre pendant 3 min. Jeter le surnageant par pipetage. Suspendre les billes dans 1 ml de PBS contenant 0,01% de Tween-20 (PBS-T). Placer les tubes sur un support magnétique et attendre 2 min. Jeter le surnageant par pipetage, puis répétez l'étape. Suspendre les billes dans 1 ml de PBS-T contenant 0,1% de BSA. Ajouter 15 ug d'IgG de souris normale ou Ab anti-FLAG et tourner à 4 ° CO / N. Isoler brièvement, puis placer les tubes sur un support magnétique et attendre pendant 3 min. Jeter le surnageant par pipetage. Suspendre les billes dans 1 ml de PBS-T. Inversez les échantillons à plusieurs reprises et centrifuger brièvement. Placer les tubes sur un support magnétique et attendre pendant 3 min, puis jeter le surnageant par pipetage. Répétez le lavagedeux fois avec du PBS-T (total de trois étapes de lavage). 8. Immunoprécipitation de la chromatine (par 2 x 10 7 cellules) Mélanger la chromatine fragmentée préparé en 5.3) (environ 800 pi) avec un cinquième du volume (environ 200 ul) de tampon de lyse modifié 3 contenant 5% de Triton X-100 (concentration finale de 1% de Triton X-100). Ajouter la solution de la chromatine dans le tube, dans lequel des billes magnétiques conjuguées protéine G avec conjugués IgG de souris normale ont été préparés. Tournez à 4 ° C pendant 1 heure. Placer le tube sur un support magnétique et attendre pendant 3 min. Transférer le surnageant dans le tube, dans lequel des billes magnétiques conjuguées protéine G conjugués avec Ab anti-FLAG ont été préparés. Tournez à 4 ° CO / N. Placer le tube sur un support magnétique et attendre pendant 3 min. Jeter le surnageant par pipetage. Suspendre les billes dans 1 ml de tampon pauvre en sel (Tris 20 mM (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, 1% Triton X-100, 0,1% SDS inhibiteurs de la protéase, et 1x) et tourner à 4 ° C pendant 5 min. Placer le tube sur un support magnétique et attendre pendant 3 min. Jeter le surnageant par pipetage et répéter l'étape de lavage. Laver les billes avec du tampon riche en sel (Tris 20 mM (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 500 mM, 1% de Triton X-100, 0,1% SDS inhibiteurs de la protéase, et 1x) deux fois. Laver les billes avec du tampon LiCl (10 mM de Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, 250 mM de LiCl, 0,5% de IGEPAL CA-630, le désoxycholate de sodium à 0,5%, et les inhibiteurs de protéase 1x) deux fois. Laver les billes avec du TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM de Tris (pH 7,5), NaCl 150 mM, des inhibiteurs IGEPAL CA-630, et 0,1% de protéase 1x) une fois. Suspendre les billes dans 200 pl de tampon d'élution (Tris 50 mM (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 0,1% de IGEPAL CA-630, les inhibiteurs de protéase 1x, et 500 ug / ml de 3 × FLAG peptide) et incuber à 37 ° C pendant 20 min. Placer le tube sur un support magnétique et attendre pendant 3 min. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml et répéter ce elutétape ions. On purifie l'ADN de faible portion (par exemple, 5%) de l'éluat par extraction au phénol-chloroforme ou en utilisant un kit d'extraction d'ADN (voir Matériaux). L'ADN purifié peut être utilisé pour la PCR avec l'amorce spécifique fixe à estimer les rendements de enChIP analyse en comparant avec l'ADN d'entrée préparé à l'étape 6.7, comme décrit précédemment 14,16. 9. SDS-PAGE, coloration, et analyse par spectrométrie de masse Mélanger l'éluat (400 ul) avec 1 ml de 2-propanol, 50 ul d'acétate de sodium 3 M (pH 5,2), et 5 ul de 20 mg / ml de glycogène. Précipiter la chromatine à -20 ° CO / N. Centrifugeuse l'échantillon (16 000 × g à 4 ° C pendant 30 min) et jeter le surnageant. Rincer le culot avec 1 ml d'éthanol à 70% et centrifuger à nouveau (16 000 xg à 4 ° C pendant 10 min). Jeter le surnageant par pipetage complètement. Suspendre le culot dans 40 ul de tampon échantillon 2x (125 mM de Tris (pH 6,8), 10% de 2-Mercaptoethanol, 4% de SDS, 10% de saccharose, et 0,004% de bleu de bromophénol). Vortex pendant 5 minutes pour dissoudre complètement la pastille, puis incuber à 100 ° C pendant 30 min pour dénaturer les protéines et inverse la réticulation. Pour SDS-PAGE, courir 40 pl de l'échantillon sur le gel jusqu'à ce que le colorant atteint 1 cm en dessous du puits. Note: Nous utilisons habituellement 4-20% des gels de gradient, mais d'autres gels% peut être utilisé. Colorer le gel avec du bleu de Coomassie ou une coloration d'argent. Couper le gel en cinq morceaux (2 mm de hauteur). Effectuer la digestion de gel et l'analyse par spectrométrie de masse comme décrit précédemment 13-16. Pour les expériences de SILAC avec 5 x 10 7 cellules chacune (total de 1 x 10 8 cellules), pastille de suspendre les cinq premiers tubes dans 40 ul de tampon d'échantillon 2x (il ne faut pas mettre à l'échelle vers le haut). 10. Purification d'ARN et ARN-Seq Analyse Pour purifier l'ARN après enChIP, ajouter 5 U / ml de RNase Inhibitor (SEe) à tous les matériaux de solutions tampons, à l'exception du tampon de lyse 3 modifié et le tampon d'élution, à laquelle ajouter 40 U / ml d'inhibiteur de la RNase. Mélanger l'éluat (400 ul) avec 16 ul de NaCl 5 M et on incube à 65 ° C pendant 2 heures. Ajouter 1 ml de réactif à base d'acide guanidinium-phénol-(voir Matériaux) à l'échantillon. Vortex pendant 15 secondes, puis incuber à température ambiante pendant 5-15 min. Centrifuger l'échantillon pendant 15 min à 12 000 x g et la température ambiante. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml et ajouter 5 pi de p-bromoanisole. Vortex pendant 15 secondes, puis incuber à température ambiante pendant 3-5 min. Centrifuger l'échantillon pendant 10 min à 12 000 x g et la température ambiante. Transférer le surnageant (environ 1 ml) dans un nouveau tube de 2 ml et ajouter 1 ml de 2-propanol. Retourner le tube et incuber à température ambiante pendant 10 min. Chargez le mélange sur une colonne dans un kit de purification d'ARN (voir Matériaux). Centrifuger la colonne pendant 1 min à 12000 × g et la température ambiante. lavagela colonne avec 400 pi d'ARN tampon de lavage dans un kit de purification d'ARN (voir Matériaux). Ajouter 80 ul de désoxyribonucléase I cocktail (mélange de 5 pi de DNase I (1 U / pl), 8 pi de 10 × DNase I tampon de réaction, 3 ul d'eau sans RNase DNase /, et 64 ul d'ARN tampon de lavage dans un kit de purification d'ARN (voir Matériaux)) de la colonne. Incuber l'échantillon à 37 ° C pendant 15 min puis centrifuger pendant 30 secondes à 12 000 × g et RT. Laver la colonne avec 400 pi d'ARN prélavage tampon dans un kit de purification d'ARN (voir Matériaux) deux fois. Eluer l'ARN avec 50 ul de DNase / RNase-free eau. L'ARN élue peut être utilisé pour le séquençage de l'ARN.

Representative Results

Dans l'ensemble, 30.1% des régions génomiques cibles peut être purifié en utilisant enChIP. La figure 3 comprend des données représentatives montrant les rendements en enChIP analyses ciblage télomères et le promoteur de l'interféron (IFN) de régulation facteur-1 (IRF-1) gène. Comme exemples de résultats typiques, tableau 1 énumère les protéines associées avec le promoteur IRF-1 d'une manière IFNy spécifique identifié par enChIP-SILAC, tableau 2 énumère les protéines télomères contraignant identifiés par enChIP couplée à la spectrométrie de masse (enChIP-MS) et Tableau 3 énumère les ARN associés aux télomères identifiés par enChIP-ARN-Seq. Figure 1. Vue d'ensemble de enChIP. enChIP utilisant CRISPR (A, B) et TAL (C, D, E </strong>) est montré. Un locus d'intérêt est étiqueté avec des molécules de liaison à l'ADN d'ingénierie comme une protéine TAL ou le système de CRISPR constitué d'une forme d'activité catalytique de cas9 (DCA) et le guide de l'ARN (ARNg). Les interactions moléculaires sont fixées avec du formaldehyde ou d'autres agents de reticulation, si nécessaire. Par la suite, la chromatine fixe est fragmenté par sonication ou digestion enzymatique. Les régions génomiques marqués sont purifiés par purification par affinité. Enfin, la réticulation est inversée, et des molécules interagissant (régions génomiques, ARN, protéines) et sont identifiés en utilisant le séquençage de prochaine génération et de spectrométrie de masse. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. Séquence de gBlock. Le promoteur U6 (en noir), le nucléotide G bvant la séquence de guidage (en bleu), la séquence de guidage (ARNg d'espacement) (en rouge), la séquence d'échafaudage (en vert), et la séquence de terminateur (en orange) sont présentées. Figure 3. Les rendements des analyses enChIP représentant. Entrées (A) Pourcentage de la cible IRF-1 locus et le locus de Sox2 non-cible. Entrées (B) de pourcentage pour les télomères de cibles et non cibles y-satellites. Les chiffres ont été adaptés et modifiés à partir de publications antérieures 15,16. Catégories Protéines Transcription DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo homologue, PURβ, activé ARN polymérase II activateur transcriptionnel p15, BTF3, Myb contraignantprotéines 1A Désacétylation des histones, les composants de co-répresseur RBBP4, PA2G4, TBL3 Acetyltransferase La protéine arginine méthyltransférase N-1 ADN topoisomérase ADN topoisomérase 2α Histones Histone H2A.Z, l'histone H3.2 Tableau 1:. Des exemples de protéines associées à l'IRF-1 région du promoteur humain de manière IFNy spécifique identifié par enChIP-SILAC Le tableau a été adapté à partir d'une publication précédente 16. Catégories Protéines Protéines télomères contraignant mammifères PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 Télomères bi-Nding protéines dans la levure ou d'autres organismes IMP4 Protéines interagissant avec des télomères contraignant protéines [protéines télomères contraignant associé] ADN-polymérase α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FOXP2-POT1], Exportin-5 [TERT], GNL3L [TRF1], Exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT] Protéines de localisation à l'hétérochromatine BEND3 Les protéines de régulation marques épigénétiques KDM5C Protéines dont les mutations affectent la fonction des télomères Α ADN polymérase (POLA1), HAT1, Nup133, CDK7, DPOE1, Prdx1, TYSY, glutamate-cystéine ligase, la glutarédoxine, SMRC1 Tableau 2:. Des exemples de protéines associées aux télomères de souris identifiées par enChIP-MS Le tableau a été ADAPTEd 'une publication précédente 15. Catégories ARN Composants de télomérase Terc, RMRP Télomérique ARN Terras scaRNAs Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 H / ACA snoRNAs Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a C / D snoRNAs Snord17, Snord15a, Snord118 lncRNA Neat1 Tableau 3: Exemples d'ARN associés aux télomères de souris identifiées par enChIP-ARN-Seq Le tableau a été adapté à partir d'une publication précédente 17..

Discussion

Here, we describe the purification of specific genomic regions using engineered DNA-binding molecules such as the CRISPR system and TAL proteins, and the identification of proteins and RNAs bound to these genomic regions. Binding of engineered DNA-binding molecules to the genome may affect chromatin structure, including nucleosome positioning, and may abrogate genomic functions, as described in CRISPR interference experiments²¹. To avoid these potential aberrant effects, we propose specific guidelines for choosing target genomic regions. First, to avoid potential inhibition of the recruitment of RNA polymerases and transcription factors, as well as disruption of nucleosome positioning around the transcription start site, the target regions for analyses of promoter regions should be several hundred base pairs upstream of (5′ to) the transcription start site. By contrast, when analyzing genomic regions with distinct boundaries, such as enhancers and silencers, genomic regions that are directly juxtaposed to these regions can be targeted because it is less likely that the binding of engineered DNA-binding molecules will affect their functions. Furthermore, it is best to avoid using target regions that are conserved among different species, because important DNA-binding molecules often bind to evolutionarily conserved regions and inhibition of their binding might disrupt the functions of the target genomic regions. In this regard, it is always necessary to check that the function of the target genomic region is maintained in the established cells used for enChIP analyses. Because multiple gRNAs can be tested easily and it is tedious and expensive to generate multiple versions of TAL or zinc-finger proteins recognizing different target genomic regions, enChIP using CRISPR is more advantageous than enChIP using other proteins.

It has been shown that dCas9 binds to off-target sites although affinity to those sites might be weaker than that to the target sites^22-25. There are several ways to manage contamination of molecules bound to those off-target sites. First, the use of several, at least two, different gRNAs would be recommended. Those molecules commonly observed in enChIP using distinct gRNAs would be true positives. Second, comparison of different conditions for enChIP would be effective in cancelling contamination of non-specific molecules and molecules bound to off-target sites. Examples of those comparison sets would be (i) stimulation (-) and (+), or (ii) different cell types such as T cells vs. B cells. Finally, quantitative analysis of binding of candidate molecules should be performed to confirm their specific binding to the target sites. It is preferable to prepare cells expressing only dCas9 but not gRNA as a negative control.

Using enChIP analyses, we were able to successfully identify a number of known and novel molecules interacting with specific genomic regions (Tables 1-3)^14-17. However, this technique failed to detect some other known proteins interacting with these regions. For example, STAT1 reportedly associates with the IRF-1 promoter upon IFNγ stimulation⁸, but our enChIP-SILAC analysis did not detect STAT1 as a protein induced to interact with this genomic region¹⁶. In addition, in the enChIP-MS analysis of telomeres, we did not detect shelterin proteins consisting of TRF-1 and TRF-2¹⁵, which have been shown to interact with telomeres²⁶. There are a few potential reasons for these discrepancies. First, the stoichiometry of binding of Stat1 to the IRF-1 promoter might be very low. It is reasonable that enChIP-MS, including enChIP-SILAC, detects proteins that are more abundantly associated with target genomic regions; hence, the analysis of more cells might be necessary to detect these proteins. Increases in the sensitivities of MS instruments would also contribute to the efficient detection of proteins with low stoichiometric binding. Second, some proteins, possibly including Stat1 and shelterins, might be difficult targets for MS analyses. Third, in our analysis of telomere-binding proteins¹⁵, the 3×FLAG-TAL proteins recognizing telomeres (3×FN-Tel-TAL) might have blocked the binding of shelterins to telomeres in a competitive fashion.

In contrast to the relative difficulty of detecting transcription factors binding to specific genomic regions using enChIP, we successfully identified epigenetic regulators such as histone modification enzymes using enChIP analyses. The success of this technique may be due to the fact that epigenetic regulators bind to a broad range of genomic regions; hence, more proteins per genomic region are available for MS. Because epigenetic regulators are increasingly recognized as important targets for drugs against intractable diseases such as cancer, enChIP would be a useful tool for the identification of epigenetic drug targets.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Fondation sciences Takeda (TF); la Fondation Asahi Glass; l'Uehara Memorial Foundation (HF); l'Kurata Memorial Technology Foundation (TF et HF) Hitachi sciences et de la; Grant-in-Aid pour jeunes scientifiques (B) (# 25830131), Grant-in-Aid pour la recherche scientifique (C) (# 15K06895) (TF); et un Grant-in-Aid pour la recherche scientifique sur de cycle de transcription »des domaines innovants (# 25118512 & # 15H01354), Grant-in-Aid pour la recherche scientifique (B) (# 15H04329), Grant-in-Aid pour la recherche exploratoire ( # 26650059) et Génome Support '(# 221S0002) (HF) du ministère de l'Éducation, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Technologie du Japon.

Materials

gBlock synthesis service	Life Technologies	Gene Synthesis by GeneArt
gBlock synthesis service	IDT (Integrated DNA Technologies)	gBlocks Gene Fragments
pSIR-neo	Addgene	51128
pSIR-GFP	Addgene	51134
pSIR-DsRed-Express2	Addgene	51135
pSIR-hCD2	Addgene	51143
TAL synthesis service	Life Technologies	GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1	Addgene	47948
3×FLAG-dCas9/pMXs-puro	Addgene	51240
3×FLAG-dCas9/pMXs-IG	Addgene	51258
3×FLAG-dCas9/pMXs-I2	Addgene	51259
3×FLAG-dCas9/pMXs-neo	Addgene	51260
anti-FLAG M2 Ab	Sigma-Aldrich	F1804
FITC-conjugated anti-FLAG M2	Sigma-Aldrich	F4049
DMEM medium for SILAC	Life Technologies	89985	Other medium can be purchased from Life Technologies
Dialyzed FBS for SILAC	Life Technologies	89986
L-Lysine-2HCl for SILAC	Life Technologies	89987	for Light medium
L-Arginine-HCl for SILAC	Life Technologies	89989	for Light medium
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC	Life Technologies	89988	For Heavy medium
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC	Life Technologies	89990	For Heavy medium
Complete, mini, EDTA-free	Roche Diagnostics	4693159
Ultrasonic Disruptor UD-201	Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D5205
Dynabeads-Protein G	Life Technologies	DB10004
RNasin Plus RNase Inhibitor	Promega	N2611
Isogen II	Nippon Gene	311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2050
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific		a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
nanoLC	Advance, Michrom Bioresources		a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
HTC-PAL autosampler	CTC Analytics		a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis

Referanslar

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Etiketler

EnChIP Genomic Region Isolation Molecular Interactions Transcription Epigenetic Regulation DNA-binding Molecules FLAG-dCas9 FLAG-TAL Cross-linking Formaldehyde Glycine Chromatin Extraction Lysis Buffer Nuclear Lysis Buffer

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Fujita, T., Fujii, H. Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP. J. Vis. Exp. (107), e53478, doi:10.3791/53478 (2016).