使用计算机辅助视频和数字图像分析量化鱼游泳行为应对水铜的急性接触

1.设置稀释器幼虫鲟鱼暴露于水铜含量采用流通式系统，如改性山和Brungs 12稀释体系以下通过ASTM国际13,14,15准则设置曝光。 选择25微克/升的基础上，绕着4-6微克/升观察疗效以前的测试结果高铜浓度。使用试剂级铜II五水合物（纯度> 98％），并搭配了一个测试原液。 注：示例浓度系列的风险敞口25，12.5，6.25，3.125，1.0625和0微克/升。开始使用25微克/升的高浓度50％的连续稀释将针对一系列观察到导致行为障碍的浓度。 48小时之前准备在容量瓶中试原液到曝光的启动和设置为投放使用穗稀释器混合室自动注射器饮水机。 使用电子表格模板，以确定要加入到1升的去离子水，这将导致在25微克/升的铜浓度，当稀释混合室用1ml试料液中掺入化学的重量。 注意： 图1描绘了用于化学备料用于稀释毒性试验的电子表格模板的实例。 称出195毫克硫酸试剂级铜二五水合物使用分析天平，倒入1升容量瓶中，并用1L去离子水混合的储备浓度的48.65毫克/升。 从自动注射器饮水机进入测试原液放置​​进气管，并设置秒杀量至1ml，并打开电源开关打开稀释并让周期为48小时使其达到平衡之前备货相应的铜浓度鲟。 附加一个直列4路分流器<s高达> 16到每个交付线，以水流量划分到每个在稀释水浴四个重复曝光室。重力进料水。循环时的电源稀释接通通过稀释器的水和电磁阀被打开，允许水流到稀释槽。设定制冷装置至15℃，并开启水泵在稀释水浴循环水。 注：此过程是通过使用一种自动计时器的调节。 使用自动计时器稀释器设定为周期每30分钟，并以带来2.50 ml的试验水的每个周期，从而导致每天12卷增补每个复制试验室中。 基于所述鲟鱼的大小选择暴露试验室在任何给定的时间保持在可接受的负荷率是<10克鱼湿重/ L的任何腔室。例如，要进行30天的后舱口（DPH）白色鲟（平均重量以克0.17克）使用12×曝光21.5厘米2玻璃瓶与侧面4厘米的洞。覆盖该侧带有30微米网孔不锈钢筛网通过测试水的，以允许流动。试验水在曝光罐子体积为1升使用50毫升的塑料注射器采取两种复制50ml水洗涤样品在每个浓度为总共12个样品和分配测试水入100毫升的玻璃烧杯中并测量溶解氧（DO），温度，导电率，pH值，碱度，硬度，总氨，主要阳离子，阴离子主要使用标准商用设备，并按照生产商的说明溶解有机碳。 注：样品应在开始和曝光的结束作出。 收集子样品进行化学分析，使用25毫升塑料注射器，使用附连到注射器而不是针一吸管吸管曝光室制定约24 ml的试验水的。 从SY取出吸管稻草RINGE并放置一个聚丙烯过滤器滤芯外壳的塑料注射器一个0.45μm孔径，聚醚砜膜。 推4毫升试验水通过过滤器和处理。 通过过滤器分配所述剩余的20 ml的试验水的成酸清洗聚乙烯瓶中并酸化至1％体积/高纯度卷，16进制硝酸的长达3个月的存储。 注：化学分析样品应在开始，中间和曝光的结束被带到确认铜的含量。 使用下面的美国环境保护署方法6020A 17电感耦合等离子体质谱法进行化学分析把所有水样和稀释的自行车，股票10（随机，随意）鲟鱼在每个复制后试验室。收集从他们使用的是小网眼非研磨网住的培养罐中的鲟鱼。将鲟鱼在一个小bucke吨，养殖水体。总共240鱼需要开始曝光。 在曝光过程中不要喂鱼。 注：请参考图1的稀释布局的可视化设置。 读取测试每天曝光和记录鱼死亡的持续时间和监测游泳行为。 注：其它终点，寻找包括昏睡，失去平衡，呼吸的变化，色素沉着，位置鱼在水柱，隐藏活动，并能直观地识别任何其他异常。 注：在同一时间阅读测试的每一天的一致性。 测量和量化游泳活动（时间鱼花费移动，速度和移动的距离）用市售的数字跟踪软件程序。 2.观测和计算死亡率在曝光目测每个测试通道琥珀和记死亡率和96小时暴露在日常使用的数据表一个行为清单（ 表1）大约在同一时间，最好是在早晨的异常行为的观察。 注：如果引人注目的是，一反常态，主观上，从管制质的差别被认为是不正常的行为。最理想的观察者不知道的治疗。 注：平衡的损失被定义为鱼无法维持水柱内的直立位置和不动性被定义为鱼无法移动或游泳除非戳。如在水柱嗜睡，多动，增加或减少呼吸，颜色的变化，震颤，痉挛，腹部臃肿，位置和其他任何不寻常的游泳方式等异常也应记录在数据表上。 注：请参阅视频1异常的例子行为。 记录和日常去除死鲟鱼。 使用带有探头举行溶解氧（DO）计，一只手测量每个接触浓度并记录在数据表上的两个重复现场和记录水温溶解氧。 3.录像制度游泳活动使用手持式摄像机捕获的视频数据的样本安装到设置在测试腔室的直接开销来记录行为异常三脚架。 量化游泳活动，切下一块的聚氯乙烯管13厘米，直径13厘米高的作为测试竞技场（ 图1）使用。放置PVC管中的每个对应的铜浓度曝光罐之内的稀释。 PVC管作为测试竞技场内使用的区域，因为这是足够大的鲟鱼约自由游动。 在96小时的曝光结束时，随机子采样5从各铜concentratio存活鲟n至衡量游泳活动，并将其放置在使用小网眼网测试的舞台。 注意：在更高的测试浓度，其中鲟死亡率为盛行，任何剩余的存活鲟应该被用于测量游泳活动，并在某些情况下，可能小于5。 放置鱼中对测试竞技场后，让鱼适应一段30分钟。 注：成功，视频的无差错分析需要的鱼对具有最小的结构，可能会掩盖或隐藏鱼的图像的背景的高对比度图像。鱼的形象必须是在良好的焦点，并且必须是自由表面眩光的或免费的，由于流动的水因此稀释系统必须关闭的扭曲。 30分钟后，打开摄像机，并设置在REC录制的游泳活动，为期2分钟。 安乐死鱼取录像，以确定是后havior。 放置鲟在三卡因甲磺酸酯（MS222）的水，至少10分钟，浓缩溶液，以允许鳃运动停止。 注：推荐至少250毫克/升的浓度，并可能对某些种类的高得多。 放置在冷冻机进行处置的塑料拉链锁袋并置于安乐死鲟在稍后的时间。关闭摄像机，并用数字跟踪软件的所有视频文件传输到电脑进行后期处理。 从视频播放游泳活动的4措施定位的数据表和视频数据文件进行分析实验。视频文件转换成兼容的格式数字分析软件可以处理。 上传的所有文件被加工成软件。通过点击图标打开跟踪软件。点击“新建默认实验”下的“创建新实验的”option主屏幕上。 对于实验在屏幕上出现的“新实验”对话框中输入名称。选择定位试验文件被保存。点击“确定”。选择在“视频源”下的“设置”。选择“从视频文件”，“实验设置”选项。 选择“1”为“赛场数”。选择“3”为“每个舞台科目数”。选择在“跟踪功能”，“中心点检测”。选择需要的单位。 选择“设置”下的“审判名单”选项。点击“添加视频”在屏幕的顶部。选择“字母顺序”下的“排序顺序”选项，在该屏幕上出现的“添加视频”对话框。点击“浏览”。导航到文件夹中的视频文件的位置。 突出显示所有视频文件。点击“打开”。点击“添加变量”在屏幕的顶部。进入“集中”到“标签“中输入”微克/升“到”说明“框中铜浓度。 选择“数值”，从下拉列表中的“类型”。点击“预定义值”对话框。选择“定义个人价值观”，在出现的“预先定义数字值”对话框中的选项。 输入“0”，“3”，“6”，“13”，“25”，和“50”中的“预定值”的空间。点击“添加>>”每个号码添加之间。取消“允许其他值”选项。点击“确定”。 选择“试用”从“范围”框下拉菜单。输入适当的浓度在提供箱，每箱的审判。点击“添加变量”在屏幕的顶部。输入“复制”到“标签”框中。输入“复制号码”到“说明”框中。选择“数值”，从下拉列表中的“类型”。 点击“P重新定义值“框中，选择”“，在选择”预先定义数字值定义个人价值观“，”2“，”“和”4“中的”1 3预定义值“对话框，输入”，“空间，点击”添加>> “每个号码添加之间。取消选中”允许其他值“option.Click”OK“。 选择“试用”从“范围”框下拉菜单。在提供框中每次试验输入相应号码重复。选择“设置”选项卡下的“竞技场设置”在屏幕的顶部。名头设置“试用1”。点击从“竞技场设置（试行1）”对话框的“抢背景图片”选项。 点击“浏览”上的“抢背景图片”对话框。找到视频文件，试行1，然后单击“打开”。视频出现后，点击“抢背景图片”对话框中“抢”选项。点击屏幕附近的UND顶部的白色圆形图标呃“竞技场设置”。 操作出现，使整个游泳区被封闭在圈圈。影线标记出现在舞台区域被定义在哪里。点击附近的“竞技场设置”下的屏幕上方“校准比例”图标。留在舞台上的一个边缘点击。按住并拖动鼠标到舞台的另一端。松开左​​键。 输入“10.5”，在出现的“校准距离”对话框中“现实世界距离”框。点击“确定”。如果需要，调整校准线，使得它跨越了圆形竞技场的整个直径。 点击“设置竞技场（试行1）”对话框“验证竞技场设置”选项。解决任何问题，如果不进行验证设置。右键点击下的“设置”选项“竞技场设置”，从“实验资源管理器”工具栏上的屏幕左侧，从菜单中选择“新建”。 重复步骤4.11-4.15，直到舞台设置h。AVE已每次试验的创建。一定要选择每次试验适当的视频文件。选择下从“资源管理器实验”工具栏中的“设置”选项，“检测设置”上的屏幕左侧。 选择“动态减法”，从下拉菜单下的“方法”中的“：检测设置1检测设置”对话“检测设置检测设置1”对话，在appears.Choose的“主题标识”下的每个主题不同的填充颜色框框。 选择“选择视频”，并在找到的“视频”下的“采样速率”框试行1.Click“打开”。选择“5.9941”视频“检测设置：检测设置1”对话框。点击“设置”下“检测”中的“参考图像”选项“检测设置：检测设置1”对话框。 点击“开始学习（C）4;选项​​，在“参考图像”对话box.Wait方案学习参考图像。曾经在“参考图像”对话框中的图像出现没有动物，单击对话框中的“使用动态参考图像”下的“采集设置”。 点击“关闭”。从下拉菜单中选择为“浓”，“主题是”下的“检测”，在“检测设置：检测设置1”对话框。设置较小的数字为“33”或更大号为“153”下“检测”“检测设置”明暗对比“：检测设置1”对话框。 点击“保存更改”在右下方的“检测设置：检测设置1”对话框。点击“播放控制”对话框中的播放按钮并确认软件成功追踪动物，而不是阴影或碎片。调整号码“黑暗反政府t“的必要。 一旦跟踪为宜，点击右下角的“保存更改”“检测设置：检测设置1”对话框。选择下从“资源管理器实验”工具栏中的“设置”选项“收购”的屏幕左侧。 在“采集设置”对话框中点击“追踪下一个计划试”。确认正确的审判，视频和舞台设定在“采集设置”对话框中的“设置”显示。 检查“采集控制”对话框中的“确定检测速度”选项。点击与封闭在一个白色方形的绿色圆圈按钮开始采集过程。重复步骤4.22-4.23，直到所有的试验已经跟踪。 从“实验资源管理器”工具栏上点击下的“分析”选项“数据配置文件”左screen.Choose“时代”的“嵌套”在option在“组件”工具栏。调整“到”“零时02分00秒”，在“选择曲目的时间间隔”中的“时间”对话框标题下。点击“确定”。 在屏幕的右侧拖动“数据配置文件”区域中的“开始”框和“结果1”框的“鸟巢”框。点击下从“实验资源管理器”工具栏上的“分析”选项“分析档案”上的屏幕左侧。点击下的“距离和时间”，在出现的“因变量”工具栏标题“速度”。 点击“速度”对话框中的“添加”。点击“移动距离”下的“距离和时间”中的“因变量”工具栏标题。点击“移动距离”对话框中的“添加”。点击“个人行为”，在“因变量”标题T下面的“运动”oolbar。 调整“离群过滤器”下的“平均间隔”到“1”中的“运动”对话框的标题。调整“启动速度”到“2.00”和“停止速度”到“1.75”下的“门槛”中的“运动”对话框的标题。 两个复选框为“动”与“不动”下的“计算统计信息”中的“运动”对话框的标题。点击“添加”，在“运动”对话框的底部。在“实验资源管理器”工具栏上点击下的“结果”选项“分析输出”上的屏幕左侧。点击“计算”在屏幕的顶部。 一旦因变量进行计算，然后单击“导出”在屏幕的顶部。选择“导出分析输出”对话框目标文件夹。从“文件类型”下拉菜单中的“导出分析Outpu选择”创先争优“T“对话框，单击”确定“。 点击“保存实验”的“文件”选项卡下在屏幕的顶部。关闭数字跟踪软件。将数据导入到电子表格文件，并使用商业统计分析软件包分析。