La cuantificación de Natación de peces comportamiento en respuesta a la exposición aguda acuosa de cobre usando asistida por ordenador y vídeo digital Análisis de Imágenes
Özet
La medición de los impactos de los contaminantes ambientales en el comportamiento de los peces es a menudo subjetiva y desafiando particularmente cuando se trata de efectos sub-letales. Se describen métodos que incluyen la tecnología de video para cuantificar el comportamiento natatorio de la vida temprana etapa de esturión blanco (Acipenser transmontanus) durante y después de 96 horas la exposición aguda a varias concentraciones de cobre.
Abstract
Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction. However, these responses may be subtle, and measurement can be challenging. Using juvenile white sturgeon (Acipenser transmontanus) with copper exposures, this paper illustrates techniques used for quantifying behavioral responses using computer assisted video and digital image analysis. In previous studies severe impairments in swimming behavior were observed among early life stage white sturgeon during acute and chronic exposures to copper. Sturgeon behavior was rapidly impaired and to the extent that survival in the field would be jeopardized, as fish would be swept downstream, or readily captured by predators. The objectives of this investigation were to illustrate protocols to quantify swimming activity during a series of acute copper exposures to determine time to effect during early lifestage development, and to understand the significance of these responses relative to survival of these vulnerable early lifestage fish. With mortality being on a time continuum, determining when copper first affects swimming ability helps us to understand the implications for population level effects. The techniques used are readily adaptable to experimental designs with other organisms and stressors.
Introduction
La comprensión de cómo la exposición a contaminantes puede afectar el comportamiento es a veces muy difícil y subjetiva. El comportamiento se define normalmente como una serie de actividades abiertas y observables, de todo el cuerpo que operan a través del sistema nervioso central y permiten a un organismo para sobrevivir, crecer y reproducirse. Los cambios en el comportamiento debido a la exposición a un tóxico son algunos de los indicadores más sensibles de estrés ambiental frecuencia entre 10-100 veces más sensible en comparación con la supervivencia 1. La mayoría de estos estudios examinaron la actividad de la natación, la ventilación y el comportamiento de alimentación de los peces 2,3,4. Natación actividad es el punto final subletal más utilizado en la determinación de un cambio de comportamiento en respuesta a un contaminante en las pruebas de toxicidad 5. las variables de natación incluyen la frecuencia y duración del movimiento, la velocidad y la distancia recorrida, la frecuencia y el ángulo de vueltas, posición en la columna de agua y el patrón de natación. La natación es la actividaduna medida eficaz de comportamiento natatorio la hora de evaluar la sensibilidad a un agente tóxico en base a los criterios propuestos en el capítulo 9 por Rand 6 en el libro Fundamentos de Aquatic Toxicology.
En este trabajo se presenta un estudio toxicológico como un ejemplo de cómo la toxicidad de cobre a primeras fases de vida del esturión blanco (Acipenser transmontanus) en diversas etapas de desarrollo temprano en el agua de sólo exposición relativa de esturión se evaluó el comportamiento de natación e ilustra métodos para cuantificar la natación comportamiento.
En estudios anteriores, las respuestas de comportamiento adversos fueron evidentes con aparición temprana durante los primeros días de la exposición aguda y crónica al cobre y se hicieron progresivamente más severos con el tiempo de exposición y la concentración 7.8.9. La magnitud y el momento de la aparición de estas respuestas de comportamiento es probable suficiente para limitar la supervivencia a largo plazo y por lo tanto son de interés dadas las implicaciones para recruiinsuficiencia tamento 10. Con el fin de interpretar con precisión la importancia de esta sensibilidad a los métodos y los procedimientos de exposición de metal se han desarrollado para la cuantificación de la evolución en el tiempo y el grado de alteraciones del comportamiento en relación con las concentraciones de cobre.
protocolos de ensayo para la función y el desarrollo del comportamiento se establecieron mediante el análisis de muestras de vídeo de arriba de esturión en cámaras de exposición. Las muestras de vídeo proporcionan una evaluación cualitativa del desarrollo y la función de los tratamientos de cobre a lo largo del período de exposición. Se evaluó la actividad de la conducta y la búsqueda de refugio durante las exposiciones a concentraciones de cobre acuosas para determinar el momento de efectuar y caracterizar la secuencia temporal de deterioro que afecta a la búsqueda de refugio, letargo, nadando la coordinación, el equilibrio y la respiración. Además, las grabaciones de vídeo fueron hechas de esturión submuestras de cada réplica con el propósito de documentar cuantitativamente natación acti espontáneavidad. Estos puntos finales incluyeron medidas de la duración o de tiempo en movimiento, nadando velocidad y la distancia recorrida 5,11 usando un paquete de software de análisis de imágenes digitales disponibles en el mercado. Este software define el contorno de cada imagen dentro de un campo de visión y de esto, se define el centro de gravedad para cada imagen. El software se puede realizar un seguimiento de la posición de cada centroide en un marco por sucesión marco para determinar las trayectorias de movimiento.
Este estudio cumplió con todas las secciones aplicables de las Reglas Finales de los reglamentos de la Ley de Bienestar Animal (9 CFR), y con todas las directrices institucionales para el tratamiento humano de los organismos de prueba durante el cultivo y la experimentación. A la finalización del estudio, todos los peces fueron sacrificados según las directrices adecuados con la aprobación por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional para el US Geological Survey, Columbia Centro de Investigación del Medio Ambiente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los cambios en el comportamiento debido a la exposición a un contaminante a menudo se utilizan como criterio de valoración de la toxicidad subletal, pero pueden ser difíciles de medir. En general, las respuestas de comportamiento se miden por medio de observaciones visuales y análisis de datos manual que requiere una gran cantidad de tiempo para procesar. Sin embargo, con el avance de la tecnología, los métodos para cuantificar la actividad de natación se han centrado en el uso de la videografía 18 y de análisis de movimiento o software de seguimiento digital que reduce el tiempo de procesamiento y análisis. Durante el análisis del vídeo capturado los datos, la cuantificación de las variables de natación manualmente habrían sido mucho tiempo por lo que el uso de grabaciones de datos de vídeo y software de seguimiento de peces provistos de una manera más eficaz y eficiente para analizar el comportamiento de natación esturión. Aunque el procedimiento destacó el comportamiento de natación de un pez, la personalización de otros organismos tales como anfibios e invertebrados acuáticos requerirían modificaciones sencillas. Dependiendo de lo que endpoin conductualts se están abordando, diseño y sistemas de cámaras experimentales pueden ser desarrollados para su uso con casi cualquier paquete de software de seguimiento disponible en el mercado.
El método se demostró utilizando cobre disuelto, pero es aplicable a otros contaminantes o características tales como la temperatura o el contenido de oxígeno acuoso. Los protocolos desarrollados y presentados en este documento utilizan una cámara de vídeo digital simple como el dispositivo de grabación. Los archivos digitales se pueden transferir fácilmente a un ordenador y se cargan en el software de análisis de movimiento. Los métodos están siendo modificados constantemente y refinado para agilizar el proceso de cuantificación. Es imperativo que la calidad de vídeo sea en alta definición para que el software de análisis para identificar a cada individuo para el seguimiento de los peces. Cualquier fondo que no contrastan con los peces causará problemas cuando se trata de procesar los archivos de datos. Otro problema común con las dos dimensiones de seguimiento de vídeo es la identificación de los individuoscuando se cruzan los caminos de natación. Esto se puede corregir manualmente mediante la identificación de cada uno de los peces durante el cruce de ruta y la vinculación de los segmentos de trayectoria dentro del software. Alternativamente, la actividad total puede ser determinada a partir de cada cámara de la replicación como una media del grupo. Varias cámaras individuales con cada uno que contiene un pescado pueden ser filmados en el mismo campo de visión para calcular los movimientos de los peces.
Actualmente hemos actualizado a la utilización de una serie de cámaras de vigilancia superiores sobre las cámaras de exposición que están vinculados a un dispositivo de grabación de vídeo digital de alta definición (HD-DVR). Sin embargo, el uso de cualquier sistema de cámara que puede grabar en alta definición MPEG-4 vídeos funcionará. El HD-DVR se puede configurar para grabar en un momento determinado y programado por hasta 7 días. Este manos libres enfoque automatizado permite la captura de varios videos al mismo tiempo para mantener la consistencia y reducir al mínimo las perturbaciones externas que puedan comprometer el comportamiento de los peces. El syste HD-DVRms se conectan a una red interna lo que la transferencia de archivos es relativamente simple. Mientras que el sistema de cámara automatizado es una técnica muy mejorado para cuantificar el comportamiento de natación, todavía es beneficioso para realizar observaciones visuales para servir como información de apoyo adicional para la documentación del deterioro del comportamiento durante las pruebas de toxicidad.
Hay una larga historia de la literatura que documenta alterado comportamiento de los peces resultantes de la exposición a los metales que datan de la década de 1960 19,20,21. El cobre se ha demostrado que causa cambios en los niveles de actividad tales como la hipoactividad de agallas azules 22 (Lepomis macrochirus Rafinesque) y los cambios en la actividad locomotora y la alimentación de la trucha de arroyo 23 (Salvelinus fontinalis). Al menos algunos peces jóvenes confían en su sentido del olfato para detectar y evitar a los depredadores, y el cobre inducida por la privación quimiosensorial puede afectar los comportamientos relacionados con la detección de sustancias químicas de alarma 24,25,26 </sup>. El epitelio olfativo está dañado debido a la exposición al cobre se afectan los mecanismos sensoriales que podrían resultar en la desorientación, la evitación conductual, reducción en la alimentación y cualquier otro comportamiento que se guían por el olfato 27. Estos comportamientos alterados fueron consistentes con lo observado durante las exposiciones.
El comportamiento de natación de esturión blanco se vio afectada en gran medida durante la exposición subletal a concentraciones de cobre acuosas .. Estos resultados ilustran cómo el comportamiento se ve afectada en concentraciones subletales de cobre y se puede utilizar como un indicador de estrés tóxico. El análisis basado en vídeo ha demostrado su eficacia en la cuantificación de la conducta natación y también sirvió como documentación visual cualitativa de los impactos severos sobre el esturión expuestos al cobre. El software de análisis también es capaz de cuantificar otros diversos criterios de valoración del comportamiento. Por favor refiérase a la Tabla 1 para obtener una lista. El sistema de exposición puede ser modificado para hacer frente a cada punto final enmodo de tiempo real y puede ser utilizado para cuantificar las diferencias en el comportamiento asociado con la exposición a diversos contaminantes de interés.
El uso de criterios de valoración del comportamiento en la investigación toxicológica acuática es cada vez más ocupados y debe ser considerado en la evaluación de los efectos de los contaminantes porque la función del comportamiento adaptativo es crucial en la determinación del daño ambiental 9. Los impactos de los contaminantes ambientales a comportamiento de los peces es a menudo subjetiva y desafiando particularmente cuando se trata de efectos sub-letales en ausencia de métodos estándar ..
Piscina actividad tal como se cuantifica mediante el uso de estos métodos se puede controlar rigurosamente, es no destructiva con el estrés mínimo para el organismo y puede repetirse. Natación comportamiento es un índice válido y consistente de la toxicidad subletal que debe ser incorporado en los protocolos de ensayo para ampliar la sensibilidad de las pruebas de toxicidad estándar 5.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the staff in the Ecology Branch, Toxicology Branch and Environmental Chemistry Branch of the U.S. Geological Survey, Columbia Environmental Research Center for technical and analytical assistance. Funding provided in part by Teck American Incorporated through an agreement with the US Environmental Protection Agency (USEPA) Region 10 with funds provided by USEPA to US Geological Survey (USGS) through the Department of Interior Central Hazmat Fund.
Materials
| copper II sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | contaminant of concern | |
| syringe dispenser | Hamilton MicroLab 600 Series | apparatus to spike chemical | |
| 2-L volumetric flask | container for holding stock solution | ||
| 24-1.5 L glass jars | test chamber for 2 dph sturgeon | ||
| video camera | Sony Handycam HDR-CX550V | ||
| digital tracking software | Noldus Ethovision | ||
| 3-17" flat screen monitors | |||
| 24 surveillance cameras | Model CL101 | ||
| 3-16 channel digital recording devices | |||
| DO meter | YSI | ||
| pH meter | Orion 940 | ||
| ph probe | Orion | ||
| ammonia meter | |||
| ammonia probe | Orion | ||
| chiller unit | |||
| recirculating water pump |
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