We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.
대부분의 포유 동물 병원체를 들어, 연구 프로파일 유전자 발현을 정확하게 감염 조직에서 병원균 유전자 성적 증명서를 정량화하는 기술적 인 문제에 의해 제한되고있다. 병원체 RNA는 감염된 조직 샘플에서 분리 된 총 RNA의 작은 부분을 구성한다. 마이크로 어레이 및 RNAseq 기술을 모두 믿을 약하게 표현 병원체 유전자 읽어 생성에 어려움이있다. 생체 내 증식의 감소와 돌연변이 병원체 균주는 더 큰 도전을 제기. 여기에서 우리는 매우 빠르고, 매우 민감하고 재현성있는 생체 내 유전자 발현 프로파일 링 프로토콜을 설명합니다. 우리는 혈행 성 전파 칸디다증의 쥐 모델에서 곰팡이 병원균 칸디다 알비 칸스의 우리의 조사 동안이 프로토콜을 개발했다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 동적으로 조절 C의 시간 과정을 문서화 알비 칸스 유전자 신장 감염 동안 식, 그리고 예기치 않은 발견 기능유전자 발현 반응은 생체 내에서 약물을 치료하는 항진균제.
유전자 발현 역학 셀이 환경 변화에 대응하는 방법에 대한 중요한 정보를 보유하고 있습니다. 미생물 감염의 경우, 유전자 발현 데이터는 병원체 감염 환경에 적응하고 호스트의 손상을 유발하는 방법에 관한 임상 적 통찰력을 제공 할 수있다. 지난 20 년 동안, 생체 외 및 생체 내 유전자 발현 연구는 대량의 데이터를 생성하고 감염 1-3 생물학을 이해하기위한 기초를 마련했다. 그러나, 마이크로 어레이를 포함하고 RNAseq 전류 프로파일 링 기술은 병원균 감염시 유전자 발현 프로파일 링에 최적이 아니다. RNA는 감염된 조직 샘플에서 분리 된 총 RNA의 절대적인 부분 (일반적으로> 99 %)을 구성하는 호스트. 호스트 RNA는 마이크로 어레이에 높은 배경에 기여하고, 순서가 RNAseq 읽 지배하고있다. 감염된 조직에서 병원균 세포 격리 이론적으로 병원체에 대한 RNA 풍부하게 할 수 있지만 이것은 또한 포즈알 문제 : 그것은 감염된 조직 다량 필요; 지루한 과정이 될 수있다; 가장 중요한 것은 긴 과정에서 원시 상태 또는 RNA의 무결성을 보존하는 것이 곤란하다. 실제 감염 병원체 중 유전자 발현에 대한 포괄적이고 정확한 데이터를 생성하기 위해, 우리는 혼합 RNA 인구 소수 RNA 종의 신뢰성과 비용 효율적인 정량화를 허용하는 프로토콜을 개발 착수.
NanoString nCounter 4, 5.이 플랫폼은 QRT-PCR에 필적 감도 레벨을 갖지만 효소 증폭을 필요로하지 않는 디지털 바코드 프로브 쌍을 이용하여 유전자 발현의 직접적인 다중화 측정한다 최근 개발 플랫폼이다. 이 기술은 전체 게놈되지 않고, 각각의 분석에서 최대 800 가지 유전자의 검출을 허용한다. 따라서 프로파일 링을위한 프로브와 같은 정보를 유전자를 선택하는 것이 중요합니다. 여기에서 우리는 주요 험의 연구 프로파일 유전자 발현을 사용예를 들어 침습성 감염시 병원체, 칸디다 알비 칸스는 설명 : 1) 실험 절차 (프로토콜)의 기술 정보, 2)이 법의 민감도, 재현성 및 동적 범위 (대표 결과), 3) 중요 이 프로토콜 (토론)를 기반으로 실험을 설계하고 수행하기위한 고려 사항. 이 프로토콜은 다양한 병원균에 대해 쉽게 적응 될 수 있고, 성공적으로 감염 모델 6-9의 숫자에 적용되어왔다.
이 프로토콜은 nanoString nCounter 플랫폼을 사용하여 세균 감염의 전사 프로파일을 최적화하기 위해 개발된다. 전체 절차는, 식 데이터를 조직 수집에서, 이하 48 시간을 필요로한다. 실습 시간은 12 샘플 약 4 시간이다. 이 프로토콜의 하나의 중요한 변수는 첫 단계에서 조직에 첨가 RLT 완충액의 양이다. 너무 작은 버퍼 페놀 클로로포름 추출 단계 이후 점성 겔의 형성을 초래할 및 RNA 회복에 대한 성상을 떠날 수있는 반면 너무 많은 버퍼가 균질 희석하고 RNA 농도를 저하로 이어질 것. (전형적인 크기 가정) 마우스 조직에 대한 버퍼의 RLT 경험적으로 결정될 최적 볼륨은 : 신장 (1.2 ㎖), 설부 (1.0 mL) 및 폐 (2.0 mL)을 첨가 하였다. 특히 이러한 사상 형태로 성장 미생물 병원체를 들어, 비드를 제패 한 단계는 완전히 휴대 내용을 공개하는 오픈 두꺼운 세포벽을 분해하는 데 도움이됩니다. 용출 단계에서, 위해서 최종 RNA를 증가시키기농도는 처음 라운드 용출액 열에 다시 첨가하고, 두 번째로 용출 될 수있다. 약 100 μg의 전체 조직의 RNA는 하나하고, RNeasy 스핀 열 (~ 2 μg의 / μL × 50 μL)에서 복구 할 수 있습니다. RNA의 더 많은 양이 필요할 경우, 제 대비 나머지 조직 파쇄로부터 제조 될 수있다. RNA 농도가 측정 될 때까지 단지의 경우, 나머지 균질 폐기하지 마십시오.
감염 모델에 따라 접종량 및 병원체 균주, 전체 조직에서 RNA 병원체 RNA의 비율은 0 % -2 %로 다르며, 일반적으로 0.05 % -0.5 %의 범위 내에. C.로부터 총 RNA의 조직, 예를 들면, 10 μg의 알비 칸스 감염 순수한 C의 10 NG와 동일한 원료 수를 생성 할 수 신장 체외 배양에서 알비 칸스 RNA (10 NG / 10 μg의 0.1 %). 조직 총 RNA의 병원체 RNA의 백분율은 넓은 범위에서 변화하기 때문에, pathoge의 양을 알고 어렵다전체 RNA의 주어진 양에 n 개의 RNA. 소모성 코드 세트를 방지하기 위해 검출 레벨 아래 병원균 RNA와 샘플들에 (250 유전자 X (192)의 반응에 대한 반응 당 비용은 약 $ 200이다), RNA의 품질 관리 단계는 각 시료 내의 병원체 RNA 수준을 결정하기 위해 수행 될 수있다. 이것은 Q-를 RT 또는 몇 하우스 키핑 유전자를 함유하는 작은 코드 세트 중 하나에 의해 수행 될 수있다.
병원체 유전자를 사용하여 정규화는 다른 시료 간의 비교 될 수있는 발현 양상 전에 중요한 단계이다. 정상화를위한 세 가지 일반적으로 사용되는 방법이 있습니다. 코드 세트의 모든 유전자에서 1. 총 계산합니다. 2. 하나 또는 소수의 '가사'유전자. 3. 기하 평균 (N N 번호의 생성물 루트 번째) 고도로 발현 유전자. 큰 코드 세트 (> 100 유전자), 좋은 선택 일 수 정규화 총 개수를 사용하여, 임의로 선택된 프로브를 수용하기 때문에 비 관련 유전자 수도 믿음 다수의 총 개수전체 RNA 입력의 양을 반영한다. 작은 코드 세트 (균사 성장 유전자 공동 규제되는 경향이 주어진 이러한 균사 성장 같은) 특정 프로세스에 집중 프로브를 함유하는 (<100 유전자), 하나를 선택하거나 몇 키핑 유전자 정상화 제어가 필수적이기 때문에. TDH3, 견고하게 표현 된 대사 유전자는 많은 실험 대조군으로 잘 역임했다. 세 번째 방법은 매우 표현 유전자에서 동등한 기여에 대한 강조와 함께, 방법 1과 2의 하이브리드입니다.
nCounter 플랫폼은 게놈 넓은 아니지만, 그것은 하나의 분석에서 최대 800 유전자 발현 수준의 정량화 할 수 있습니다. 따라서, 분석하는 가장 유익한 유전자를 선택하면 프로파일의 성공을 위해 중요하다. 프로브를 선택하는 두 가지 방법이 사용되어왔다. 첫 번째 방법은 "기초 지식"입니다. 게시 된 표현과 기능 데이터의 정보는 현재 잠재적 인 관심있는 유전자 화면으로 컴파일이러한 환경 응답 유전자 6-9로 공부합니다. 이 방법은 생체는 따라서 데이터 해석에 대한 컨텍스트를 제공하고, 기존의 많은 데이터 세트에 데이터를 프로파일 링을 쉽게 비교 할 수 있습니다. 두 번째 방법은 "기초 탐사"이다. 이러한 전사 인자, 또는 키나제 세포벽 단백질을 지정하는 모든 유전자로서 미생물 게놈 유전자의 범주는 프로브 선택된다. 이 접근법은 생체 데이터 6에 기초하여 프로파일 신규 병원성 인자 및 신규 규제 관계 발견을 식별 할 수있다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NIH 보조금 R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM 및 SGF), R01 AI054928 (SGF), 및 R01 DE017088 (SGF)에 의해 부분적으로 지원되었다.
gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
Phenol:ChCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |