Filtro Analisi aria-campionato per endotossine e contenuto di DNA
Özet
Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.
Abstract
la ricerca di aerosol all'aperto comunemente utilizza il particolato di campionamento su filtri. Questa procedura permette diverse caratterizzazioni di particelle raccolte da eseguire in parallelo. Lo scopo del metodo qui presentato è quello di ottenere un'analisi molto accurata e affidabile della endotossina e DNA contenuto di bio-aerosol estratte dai filtri. L'estrazione di alto peso molecolare molecole organiche, come lipopolisaccaridi, da filtri campione comporta agitando il campione in un mezzo a base di acqua apirogena. La successiva analisi si basa su una reazione enzimatica che può essere rivelato utilizzando una misurazione turbidimetrico. Come risultato di elevato contenuto organico sui filtri campione, l'estrazione del DNA da campioni viene effettuata usando un kit di estrazione del DNA commerciale che è stato originariamente progettato per suoli e modificato per migliorare la resa DNA. L'individuazione e la quantificazione delle specie microbiche specifici utilizzando riatti a catena della polimerasi quantitativaon (q-PCR) sono descritti e confrontati con altri metodi disponibili.
Introduction
Campionamento dell'aria sui filtri è uno strumento fondamentale nella ricerca aerosol atmosferico. 1 I filtri campionati sono il punto di partenza per varie chimiche, fisiche, e caratterizzazioni biologiche delle particelle ambientali raccolti. 2-11 Il vantaggio di questo approccio è che varie analisi possono essere eseguito off-line sullo stesso campione. Compilare i dati provenienti da tutte le diverse analisi permette al ricercatore di ottenere una buona comprensione delle caratteristiche delle particelle raccolte e aiuti a risolvere questioni complesse nel campo delle scienze atmosferiche. 12,13 Per esempio, marine ed interne aria-campioni prelevati durante la stessa periodo può essere confrontata rispetto alla tossicità particelle campionata e composizione biologica. 14 per questo studio, lipopolisaccaridi (LPS), componenti batteriche pareti cellulari gram-negativi, noto anche come endotossine, sono stati estratti dai filtri campionata on-shore ea un sito interno, e sono stati valutati utilizzando ilLimulus lisato di amebociti (LAL). In parallelo, una valutazione genomica della carica batterica (batteri totali, gram negativi, e cianobatteri) è stata eseguita sullo stesso campione usando la reazione a catena della polimerasi quantitativa (q-PCR). Il test LAL si basa su misure di torbidità formate in seguito all'aggiunta di un estratto acquoso di amebociti dal limulo, Limulus polyphemus, ad una soluzione acquosa contenente le endotossine. Maggiore è la concentrazione di endotossina nel campione, la torbidità veloce sviluppa. 15 L'analisi q-PCR si basa su un segnale di fluorescenza emessa da uno specifico frammento di DNA amplificato. 16 Con il monitoraggio in tempo reale del segnale durante la fase esponenziale della PCR reazione e calibrazione con una curva standard, l'importo iniziale di DNA possono essere quantificati. La combinazione di queste due analisi insieme ad altri, come descritto altrove, 14 possono fornire una buona stima dei livelli di endotossina equantità di batteri di origine nei campioni.
Lo scopo del metodo qui presentato è quello di ottenere un'analisi molto accurata e affidabile della endotossina e DNA contenuto di bio-aerosol estratte dai filtri. Mentre i metodi per il campionamento delle caratteristiche chimico fisiche ed inorganici aerosol sono ben noti e, più recentemente, sono stati sviluppati metodi per indagare sua componente materia organica, 17 vi è stata la ricerca scarsa sulla componente biologica di aerosol. 18 Il razionale per la corrente il metodo è quello di affrontare questa lacuna presentando in dettaglio un metodo robusto per l'estrazione, l'analisi e l'identificazione la frazione biologica di aerosol nell'aria. 14
Il metodo descritto qui è prevista per trovare impiego diffuso in progetti di ricerca biologica per interni ed esterni di aerosol che coinvolgono l'analisi del filtro. 20-24
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo lavoro descrive i metodi di estrazione e di rilevazione per quantificare sia endotossine e DNA presente in campioni di aerosol raccolti su filtri. I metodi richiedono routine accurati e possono essere eseguiti facilmente finché sperimentatore aderisce ad alcuni punti essenziali ed importanti discussi qui.
Per la fase di rilevazione endotossine, si noti che la soluzione lisato è molto viscoso e tende a produrre bolle su pipettaggio. E 'difficile da rimuovere te bolle, e si portan…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Yoav Barak from the Chemistry Faculty, Weizmann Institute, for support and advice. This study was supported by the Israel Science Foundation (grant # 913/12), and by the Minerva Foundation with funding from the Federal German Ministry for Education and Research.
Materials
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 – High Air Volume Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203mm X 254mm |
| ELF – Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 mL sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series – Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 mL |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 Microns | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 microns | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
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