Optimierung der Wund Scratch Assay auf Änderungen in Murine mesenchymale Stromazellen Zellmigration Detect nach der Beschädigung durch lösliche Cigarette Smoke Extract

Zellmigration ist hoch koordinierter und entscheidend für viele physiologische Prozesse, wie beispielsweise der Gewebeentwicklung, Reparatur und Regeneration sowie pathologischen Prozessen wie Krebsmetastasen und Arteriosklerose ^1. Ein Verständnis der Zellmigration ist besonders relevant für Emerging Therapien eingesetzt, um beschädigte Gewebe zu reparieren und zu behandeln pathologischen Zuständen, einschließlich Zelltransplantation Technologien und künstliche Gewebe Pfropfen ^2. Angesichts der gegenwärtigen Interesse an der Rolle von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) bei der Vermittlung der Reparatur von Gewebe ^3, Quantifizierung der Migrationsfähigkeit dieser Zellen unter Verwendung eines Assays, die streng quantifizierbare, anpassungsfähig und kosteneffektiv ist von Interesse ist. Wichtig ist, dass ein solcher Test, relativ geringfügige Änderungen in der zellulären Migrationsfähigkeit nach Beschädigung ausreichend empfindlich sein. Aktuelle Methoden zur Quantifizierung der Zellmigration, einschließlich Grund auf Assays, trans-und Migrationsassays (Boyden chBernsteine), micropillar Arrays und Zellsperrzone Assays besitzen eine Reihe von Einschränkungen in der Reproduzierbarkeit, Anpassbarkeit, Quantifizierung und ^{Kosten-Nutzen-1,4,5.} Die hier beschriebene optimierte Kratz Test zeigt robuste Ergebnisse, quantifizierbar und bildbasierten Analysemöglichkeiten, Wirtschaftlichkeit und Anpassungsfähigkeit an andere Anwendungen.

Scratch-Assays sind in mehreren Kapazitäten verwendet worden, um die Zellmigration und Proliferation unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ⁵ zu beurteilen. Der Test beinhaltet Aussäen der bezeichneten Zellen, wächst sie in oder in der Nähe Zusammenfluss abgeschlossen ist, und ein Verkratzen der resultierenden Monoschicht mit einer sterilen Nadel oder Pipettenspitze ^6. Analyse wird am häufigsten durch Vergleichen der Breite des Kratzers über mehrere Zeitpunkte an zufällig ausgewählten Stellen ^7-9 durchgeführt. Trotz seiner prominenten Gebrauch wird der Kratztest durch Probleme mit der Reproduzierbarkeit und Quantifizierung verwechselt. VariabilitätGeneration des Scratch nicht verändert nur die Mikroumgebung der Zellen, sondern kann auch die Zellmigration zu verhindern, indem die Plattenoberfläche und die zugrunde liegenden extrazellulären Matrix ⁵ zu beschädigen. Assays werden häufig mehr als 7 bis 12 h durchgeführt, jedoch für die Zelllinien Anzeige langsamer Migration und längere Testzeiten wird die Proliferation eine verwirrende Variable ^7,10. Schließlich kann seneszenten Zellen durch den Ritzvorgang erzeugten Faktoren, die mit der extrazellulären Signalisierung benötigt, um die Lücke in der Monoschicht ¹ schließen stören zugeben. Optimierung des Kratztest erfordert die Schaffung eines konsistenten Lücke, die nicht mit Oberflächeneigenschaften nicht beeinträchtigt, die Minimierung Assay Zeitlänge und verhindert unerwünschten Zelltod während der Manipulation. Der Anschlag basierenden Assay ist eine Optimierung der Zellausschlusszone Assay. Dieses Assay wendet einen Anschlag in der Mitte der Vertiefung, die das Zellwachstum schließt platziert, aber erlaubt den Zellen, um den zentralen Sperrzone plattiert werden.Um die Migration zu bewerten, wird der Anschlag entfernt und der sich ergebende Sperrzone stellt eine Oberfläche zur Migration auftritt. Allerdings ist dieser Test schwierig gestalten oder anzupassen ¹⁰ und für einige Anwendungen kann diese Technik auch zu kostspielig.

Im Gegensatz zu Kratzassays und deren Derivaten, trans-well Migrationsassays (oder Boyden-Kammer-Assays) beurteilt Migration durch Quantifizieren der Anzahl von Zellen, die von einer Kammer zu bewegen, durch eine mikroporöse Filtermembran, in eine Kammer, die chemotaktische Mittel ^{8,11, 12.} Diese Technik hat einen Nutzen für adhärente Zellen, wie MSCs begrenzt, da nach der Migration durch die poröse Membran, Zellen haften an der Membranseite auf die chemotaktische Mittel ausgesetzt wird, und kann schwer genau zu quantifizieren. Während der Test ist in der Lage, einige dreidimensionale Migrationsmuster zu untersuchen, die eingeschränkten Zelltypen, für die sie in der Lage, genau zu quantifizieren Zellmigrationsgrenzwert seine Nützlichkeit ist ¹⁰. Eine weitere Alternative zur Kratzassays verwendet einen Mikrosäulenarray, das zelluläre Motilität durch einen dreidimensionalen Raum misst unter Verwendung der Fähigkeit der Zellen, sich zu verformen und die Migration in das Array als Surrogat. Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomeren über einen präzisen Form gehärtet und mit Ozon behandelt und Fibronektin erzeugt ein homogenes und nicht-abbaubare Mikroumgebung. Mikrosäulenabstand kann bei Bedarf auch um die Fähigkeit der Zellen, um das Array ⁴ geben abzuschätzen variiert werden. Die Form wird durch tiefe reaktive Ionen-Ätzung von Siliziumwafern geschaffen, um eine negative Version des hohen Aspektverhältnisses ^Array 13 zu schaffen. Während der Assay wird durch seine Anpassbarkeit verstärkt, um die Fähigkeit dreidimensionalen Migration, und die Analyse durch die direkte Visualisierung von wandernden Zellen zu modellieren, die Schwierigkeit bei der Schaffung von Mikrosäulenanordnungen wirtschaftlich behindert ihre weitverbreitete Verwendung.

Die in diesem Protokoll beschriebenen optimierte Kratz Assay stellt ein effizientes, cost günstiges Verfahren zum Erzeugen konsistenter Kratzer, die durch frei verfügbaren Software analysiert werden können. Statt einfacher Breite Messungen über die Kratz vor und nach der Zellmigration hergestellt, ermöglicht die Software dem Anwender insgesamt kratz Bereiche vor und nach der Migration zu ermitteln. Dieser Fortschritt schränkt das Problem zu versuchen, festzustellen, wo die Kratz die Breitenmessungen sollten getroffen werden, und ob die Breite des Kratz einheitlich entlang ihrer Gesamtlänge. Außerdem ist eine sorgfältige Optimierung der Zellzahlen, die Zellkonfluenz und der Art und dem Grad der Beschädigung an den Zellen zugefügt, um eine weitere Optimierung der Assay erörtert.