مضان الانتعاش بعد دمج قطرات لقياس انتشار ثنائي الأبعاد من الفوسفوليبيدية واحد رقائق
Özet
We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.
Abstract
We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.
Introduction
الفوسفورية هي المكونات الرئيسية لأغشية الخلايا والأغشية العضيات، وسيولة من هذه الطبقات غشاء غالبا ما يؤثر الوظائف الخلوية عن طريق تغيير النشاط من بروتينات الغشاء 1-3. على سبيل المثال، غشاء ويتحقق التوازن الدهون من خلال تنظيم سيولة الغشاء، والتي تم الكشف عنها بواسطة بروتينات الغشاء، ومستوى غير طبيعي للسيولة يسبب أمراضا خطيرة، مثل تشحم الكبد والكوليسترول 4. بالإضافة إلى ذلك، سيولة أحادي الطبقة فوسفورية في واجهة السائل الهواء الحويصلات الهوائية آثار هامة في وظائفها. سيولة عالية من بالسطح الرئة فسفوليبيد أحادي الطبقة يسهل انتشار طبقة أثناء الشهيق، في حين أن سيولة منخفضة تمكن طبقة البقاء داخل الحويصلات الهوائية أثناء الزفير 5،6. وبالتالي فمن المهم تقدير سيولة طبقات فوسفورية على فهم أدوارهم.
_content "> مقياسا مباشرا للسيولة هو اللزوجة، وقد تم قياس اللزوجة من طبقات فوسفورية باستخدام ميكرون الحجم الغرويات 7، الإبر المغناطيسية 8،9، والمغناطيسية أزرار الدقيقة 6،10،11. ومع ذلك، هذه التقنيات تقتصر على الأفلام جامدة نسبيا، ولا يمكن قياس الأفلام أقل لزوجة. وبالنسبة لهذه الحالات، فإن انتشارية يكون بديلا لقياس سيولة طبقات فوسفورية. على مدى عدة عقود، وقد وضعت مجموعة متنوعة من التقنيات لقياس خصائص نشر طبقات فوسفورية، مثل مضان طريقة تبريد 12، حقل نابض التدرج NMR 13، والتحليل الطيفي الارتباط مضان (FCS) 14. واحدة من الطرق الأكثر تمثيلا غير الانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP) 15،16. ونظرا لبساطة إجراء القياس وما يتصل بها وقد أجريت النظريات، العديد من الدراسات حول خصائص انتشار طبقات فوسفورية باستخدام FRAP <suP> 17-19. ومع ذلك، FRAP يتطلب عادة مكلفة الإعداد المجهر مبائر مع ليزر عالية الطاقة.هنا، نقدم تقنية جديدة لقياس انتشار الأفقي من الطبقات الوحيدة فوسفورية، توصف بأنها انتعاش مضان بعد دمج (فرام). الفرق الرئيسي بين FRAP وفرام هو أن الخطوة photobleaching من يحل محله انخفاض التحام. دمج قطرات من قبل غير مضان أحادي الطبقة غطت على أحادي الطبقة مسطحة fluorescently المسمى يترك لطخة سوداء دائرية على أحادي الطبقة مسطحة زاهية، وبالتالي إقامة دولة واحدة أولية مع الخطوة photobleaching من. ثم أننا نلاحظ الانتعاش مضان في لطخة سوداء مع الوقت لقياس انتشارية الجانبي. هذا "تبييض" خطوة جديدة قطرة التحام يوفر مزايا هامة على FRAP: فرام يتطلب سوى مضان المجهر بدلا من مجهر متحد البؤر مكلفة مع ليزر عالية الطاقة ما هو ضروري لFRAP. أنان بالإضافة إلى ذلك، فرام لديها تشكيلة واسعة من الأصباغ مضان لأنها لا تنطوي على عملية photobleaching من. وأخيرا، وهما الطبقات الوحيدة مختلفة، أحادي الطبقة قطرة وأحادي الطبقة مسطحة، ويمكن أن تكون مستعدة بشكل مستقل، مما يسمح interdiffusion إلى أن تقاس، في حين FRAP يقيس فقط نشر الذاتي من الطبقات الوحيدة.
يوفر فرام مجموعة واسعة من القياسات نشر من مواد لزجة جدا للمواد inviscid تقريبا. من حيث المبدأ، يمكن فرام قياس انتشارية الأقصى من 10 6 ميكرون 2 / ثانية، وهو مشابه لتقنيات القائمة، عند حدوث نشرها في جميع أنحاء المنطقة 100 ميكرون 100 ميكرون في الوقت المناسب لعملية الهبوط التحام (~ 10 ميللي ثانية). وعلاوة على ذلك، عملية نشر بطيئة يمكن قياسها بسهولة ما لم الطبقات الوحيدة هي الصلبة. فرام يمكن استخدامها لأي من المواد الفعالة السطحية أنواع طالما مناسبة جزيئات الموسومة fluorescently المتاحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
فرام تشترك في الكثير من المبادئ الأساسية مع FRAP، وخاصة لقياس الانتعاش بعد مضان تبيض منطقة معينة، ولكن يستخدم فرام عملية دمج قطرات على واجهة مسطحة لتشكيل منطقة المبيض، بدلا من تطبيق الضوء المكثف. عملية دمج وهكذا أهم خطوة في فرام، وخاصة، وشكل لطخة سوداء في أحادي الطبقة مسطحة بعد دمج قطرات يحدد دقة القياس الانتشارية. على وجه التحديد، استنادا إلى الطريقة الحالية، ونحن فقط تعيين دائرة نصف قطرها R كمنطقة ذات الاهتمام لحساب متوسط كثافة لطخة سوداء، كما هو موضح في إجراء 4، وإذا كان هناك الكثير من الانحراف عن الشكل الدائري، هذا من شأنه تعكير صفو قياس دقيق لمعامل الانتشار. وبالتالي، فمن الضروري للحصول على المنطقة الداكنة على شكل دائري، ولكن، يتم تشكيل الأشكال noncircular في بعض الأحيان نظرا لعدة أسباب. أولا، في حال وجود تدفق الحمل الحراري في الحيوانات الأليفةطبق ري، شكل منطقة مظلمة يصبح ممدود على طول اتجاه التدفق. كما هو مذكور في الإجراء 1.3، وهو جهاز مخروطية الشكل يساعد على منع تدفق الحمل الحراري، وسيتم التقليل من هذه الاستطالة. ثانيا، إذا كان في نهاية غيض من الشعرية تلامس واجهة مسطحة خلال عملية الدمج، ويتم تشكيل منطقة مظلمة مع مجموعة متنوعة من الأشكال منذ نهاية الشعرية المقاطعات عملية الدمج. عن طريق الحصول على قطرة أن هو معلق فقط من نهاية جدا من الشعيرات الدموية، ويمكن الوقاية من هذا الانقطاع. على وجه الخصوص، علاج مسعور من الشعرية يساعد الحبرية للجلوس في النهاية من الشعيرات الدموية. ولذلك، إطلاق النار المتاعب المذكورة أعلاه والتعديلات تمكننا من قياس خصائص الانتشار على نحو أدق.
وبالتالي يسمح هذا عملية troubleshot جيدا فرام لديك عدة مزايا هامة على FRAP. أولا، يتطلب فرام المعدات أبسط مقارنة مع FRAP. لفرام، فإنه يكفي لاستخدام مايكروين مضان بسيطةالتعامل، بدلا من مجهر متحد البؤر مكلفة مع ليزر عالية الطاقة التي يجب أن تتطابق مع الطيف امتصاص الصبغة الطول الموجي. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الضروري استخدام جهاز إضافي لضبط حجم لمنطقة المبيض في FRAP، في حين تسيطر على فرام حجم المنطقة بسهولة عن طريق ضبط حجم القطيرات، أو الضغط السطحية على سطح الحبرية. ثانيا، من الممكن استخدام أنواع مختلفة من الأصباغ في فرام. FRAP يستخدم فقط جزيئات الصبغة التي هي أسرع بكثير من عملية نشر عملية التبييض. إذا كان نشر الأصباغ يحدث أثناء عملية التبييض، وأنه من الصعب تقدير الممتلكات نشرها بدقة. فرام، ومع ذلك، لا تتطلب عملية لتبيض الأصباغ وهذا بالتالي يمكن استخدام أنواع مختلفة من الأصباغ في التصوير مضان. بالإضافة إلى ذلك، FRAP يتطلب الليزر إضافية عالية الطاقة ومرشح يضع لتغيير نوع الصبغة، في حين أنه من الضروري فقط لاستبدال مجموعات مرشح في فرام. أخيرامنذ الطبقات الوحيدة على سطح قطرة واجهة مسطحة يمكن تشكيلها بشكل مستقل، وبالتالي تمكين دراسة بين نشر أو خلط بين الطبقات الوحيدة الدهون المختلفة من خلال دمج وهناك نوع أحادي الطبقة إلى B-نوع أحادي الطبقة، في حين أن FRAP يقيس فقط نشر الذاتي للأحادي الطبقة.
وعلى الرغم من هذه المزايا، فإن عملية دمج قطرات على واجهة بين الهواء والماء مسطحة يمكن أن تحد هذه التقنية بسبب العديد من القضايا التي قد تكون مثيرة للقلق، مثل عدم تطابق ضغط السطح بين الطبقات الوحيدة، وهما النطاق الزمني لعملية الدمج ، وزيادة في ضغط سطح أحادي الطبقة مسطحة بعد دمج قطرات. هذه القضايا، ومع ذلك، لا يؤثر على قياس انتشار كبير للأسباب التالية. أولا، على الرغم من الضغوط السطحية في اثنين من الطبقات الوحيدة المختلفة هي مختلفة تماما، اكتمال عملية موازنة في مرحلة مبكرة جدا أثناء عملية الاسترداد. على سبيل المثال، إذا ركان السطح ضغط أحادي الطبقة على سطح القطيرات هو أعلى من أحادي الطبقة في واجهة بين الهواء والماء مسطحة، توسع منطقة مظلمة حتى equilibrates ضغط السطح. منذ الانتهاء من هذه العملية في غضون 10 ميللي ثانية، سيتم المتوازنة ضغط السطح قبل أن يؤثر على عملية الانتشار بشكل ملحوظ. ثانيا، إذا كان النطاق الزمني لعملية دمج سريع بما فيه الكفاية، فإنه لا يحد من قياس نشر على الإطلاق. لحسن الحظ، يتم إكمال عملية دمج نموذجية أيضا في غضون 10 مللي ثانية. وأخيرا، دمج حتى عدة قطرات على واجهة مسطحة لا زيادة ضغط السطح منذ مساحة الحوض الصغير هو أكبر بكثير من المساحة السطحية للالحبرية. وفقا لأحجام الحوض الصغير وقطرات، هو موضح في البروتوكول، والمساحة المخصصة لكل جزيء يزيد أقل من 0.015٪ عن طريق دمج قطرة. وفقا لذلك، وزيادة ضغط السطح نتيجة لتغيير المساحة لكل جزيء أقل من 0.1٪، وهو negligiblه لأنه أصغر بكثير من الخطأ نموذجي في ضغط السطح، مقاسا Wilhelmy لوحة مقياس التوتر السطحي.
باختصار، قدمنا طريقة جديدة لقياس خاصية الانتشار الأفقي للأحادي الطبقة فوسفورية خلال دمج أحادي الطبقة قطرات على واجهة مسطحة. هذه التقنية تتطلب معدات بسيطة نسبيا وتمكن أيضا استخدام أنواع مختلفة من أنواع الصبغة. فرام بالتالي يمكن تطبيقها لقياس نشر أي عوامل نشطة السطح، بما في ذلك الفوسفورية، بوليمرات كتلة والبروتينات وحتى النانوية في واجهة السائل السائل. وعلاوة على ذلك، فإننا نتوقع أن فرام يوفر طريقة جديدة لدراسة بين نشر أو خلط بين مختلف عناصر نشطة السطح.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويؤيد هذا العمل من قبل K-وادي RED & B مشروع ممول KAIST-لعام 2014 وبرنامج بحوث العلوم الأساسية من خلال المؤسسة الوطنية لكوريا البحوث (NRF- 2012R1A6A3A040395، جبهة الخلاص الوطني، 2013R1A1A2057708، NRF- 2012R1A1A1011023).
Materials
| Acetone | OCI corporation | Acetone 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
| Ethanol | OCI corporation | Ethanol 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
| Deionized water/Water purify system | Millipore | Milli-Q liocel | >18.2 MΩ·cm |
| Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic. |
| Chloroform | LiChrosolv | Chloroform ultrapure (A3633) | Purity: ≥ 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic |
| Rhodamine DPPE | Avanti Polar Lipids | 810158C, 810158P | Avoid direct light exposure to prevent photobleaching |
| Wilhelmy plate tensiometer | R&K ultrathin organic film technology | Wilhelmy tensiometer | http://www.rieglerkirstein.de/index.htm |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | |
| Micro-injector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Micromanipulator 5171 | |
| Microscope 1 | Objective lens: Olympus | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10x NA 0.3 |
| Microscope 2 | Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10x NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm |
| CCD for Microscope 1 | Jai | CV 950 camera | |
| CCD for Microscope 2 | Andor | iXon3 EMCCD | |
| Filter set | Chroma technology | Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605 | Prepare suitable for dye molecules |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | Wiseclean WUC-D06H |
Referanslar
- Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
- Christon, R., Even, V., Daveloose, D., Léger, C. L., Viret, J. Modification of fluidity and lipid—protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency. Biochim. Biophys. Acta – Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).
- Stubbs, C. D., Smith, A. D. The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function. Biochim. Biophys. Acta – Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).
- Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
- Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).
- Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).
- Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion. Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101 (2014).
- Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a., Schwartz, D. K. Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers. Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).
- Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. Active interfacial shear microrheology of aging protein films. Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).
- Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
- Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers. Nature Commun. 2 (5), 312 (2011).
- Caruso, F., et al. Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements. J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).
- Filippov, A., Orädd, G., Lindblom, G. The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers. Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).
- Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes. Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).
- Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D. Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory. Biyokimya. 24 (3), 781-786 (1985).
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching. Biyokimya. 16 (17), 3836-3841 (1977).
- Peters, R., Beck, K. Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).
- Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H., Crawley, J. N., et al. . Physical Methods of Chemistry. 1, Part 3B, 651-653 (1972).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochim. Biophys. Acta – Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).
- Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces. J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).
- Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces. Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).
