Özet

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

Published: September 29, 2017
doi:

Özet

이 프로토콜을 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 3 차원 (3D) 영상 및 분석 기법을 사용 합니다. 기술 한 형광 신호를 다른 형광 신호에서 데이터의 하위 집합을 분리 하는 데 사용은 다른 상황에 적용 됩니다.

Abstract

이 프로토콜의 목표 intraepidermal 신경 섬유 내에서 미토 콘 드리 아 연구입니다. 따라서, 3D 이미징 및 분석 기술은 신경 특정 미토 콘 드리 아를 격리 하 여 평가 하는 감각 신경의 말 초에 있는 미토 콘 드리 아의 질병 유발 변경 개발 되었다. 프로토콜 형광 immunohistochemistry, confocal 현미경 검사 법 및 3D 이미지 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 분석 기법을 결합 합니다. 상세한 매개 변수는 이러한 기술을 사용 하 여 신경 특정 미토 콘 드리 아를 분리 하는 방법의 구체적인 예를 제공 하기 위해 절차를 통해 정의 됩니다. 항 체 신경 라벨을 사용 했다 하 고 피부의 조직 섹션에서 미토 콘 드리 아 신호 펀치 생 검는 각각 신경 및 미토 콘 드리 아 녹색과 적색 형광 신호를 시각화 하는 간접 면역 형광에 의해 그 뒤를 이었다. 부터 Z-시리즈 이미지 confocal 현미경 검사 법으로 인수 했다 고 3D 분석 소프트웨어 처리 하 고 신호를 분석 하는 데 사용 되었다. 그것은 정확한 매개 변수, 설명에 따라 필요가 없습니다 하지만 얼룩, 수집 및 분석 단계를 통해 선택 하는 것 들과 일치 하는 것이 중요 하다. 이 프로토콜의 힘 그것은 다양 한 상황에 적용 한 형광 신호를 사용 하 여 그렇지 않으면 불가능 한 것을 혼자 공부 하는 다른 신호를 분리 하는 곳입니다.

Introduction

미토 콘 드리 아 세포 에너지, 칼슘, 그리고 괴 규제, apoptotic 세포 죽음1,2,3버퍼링 생산을 포함 하는 중요 한 세포 기능을 제공 합니다. 신 경계는 미토 콘 드리 아 호흡을 통해 뉴런 아데노신 3 인산 염 (ATP)의 형태로 세포 에너지의 높은 수준의 생성 제안 몸4 에 비해 높은 신진 대사 속도 있다. 많은 신경 기능 ATP5,6시 냅 스 특히 의존 하는 증거 문서. 따라서, 신경 세포 내 미토 콘 드리 아의 유통이 중요 합니다.

정보를 많이 보여주었다는 인신 매매와 신경 미토 콘 드리 아의 도킹 지난 10 년 동안은 매우 통제. 모터 단백질 신경 통해 특정 세포 구획을 미토 콘 드리 아를 배포에서 포함 된다. 뉴런 프로젝트 축 삭과 dendrites soma에서 멀리 떨어져 있기 때문에 미토 콘 드리 아의 인신 매매 하는 것이 특히 중요 합니다. Kinesin 모터 단백질 주로 직접 (소마)에서 참가자 다 모터 단백질 직접 (소마) 쪽으로 역행 운동7,,89 동안 microtubules 따라 미토 콘 드리 아의 매매 , 10. 같은 미토 콘 드리 아 막 잠재력과 존재와 미토 콘 드리 아 밀매11,,1213의 방향에 영향을 주는 충 동 전도 셀룰러 신호가 있다.

미토 콘 드리 아, 수송 이외에 미토 콘 드리 아 노드의 Ranvier, 시 냅 스8,14, 등의 높은 에너지 요구를 있는 특정 세포 구획을 지역화 하려면 특수 단백질 17. 사실, 축 삭 내의 미토 콘 드리 아의 대다수는 비 운동9,13,18. Syntaphilin 앵커 걸 골격1921을 다른 단백질 앵커 미토 콘 드리 아 동안 축 삭을 따라 microtubules에 미토 콘 드리 아 같은 특수 단백질. 성장 인자와 같은 칼슘 이온의 미토 콘 드리 아 운동 어디 그들은 필요한21,,2223지역에 지역화를 지원 하기 위해 보고 되었다.

함께 찍은, 밀매 하 고 미토 콘 드리 아의 도킹 뉴런의 적절 한 기능을 위해 생명 이다. 이 지원 중단 미토 콘 드 리아 인신 매매에 연결 되었습니다 Alzheimer의 질병, 루 경화 증, Charcot Marie이 질병, Huntington의 질병, 유전 경련을 포함 하 여 여러 신경학 상 조건 paraparesis, 그리고 광섬유 위축15,,2425,26,27. 최근 연구 결과 당뇨병 신경 병, 당뇨병28,,2930,31과 관련 된 감각 손실에 대 한 잠재적인 메커니즘으로 미토 콘 드 리아 기능 장애 및 병 리에 집중 했다 ,,3233. 가설은 당뇨병 피부 신경 결말의 감각 계획 내의 미토 콘 드리 아의 배포 변경입니다. 따라서, 기술은 시각화 하 고 계량 미토 콘 드리 아 intraepidermal 신경 섬유 (IENFs), 지 루트 신경 절 감각 afferents의 원심 끝에 내에서 개발 되었다. 기술을 결합 하 여 특정 미토 콘 드리 아와 신경 섬유 라벨의 형광 immunohistochemistry confocal 현미경 검사 법부터 z-시리즈 수집 관련 신경의 분포를 측정 하기 위해 강력한 3 차원 이미지 분석 소프트웨어와 신호 미토 콘 드리 아에서 인간의 피부 펀치 생 검이이 목표를 달성 하기 위해.

Protocol

피부 펀치 생체 검사 (솔트 레이크 시티, 유타) 유타 대학 당뇨병 센터에서 큰 지역 사회 기반의 1 차 진료소 네트워크에서 모집 된 과목에서 얻은 했다. 이 연구는 미시간 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었고 헬싱키의 선언의 신조를 준수. 테스트 하기 전에 각 주제에서 동의 얻어 작성. 1. 형광 Immunohistochemistry intraepidermal 신경 섬유 immunohistochemistry 위한 준…

Representative Results

시각화 및 인간 IENFs 내 미토 콘 드리 아의 정량화 형광 immunohistochemistry 신경, 미토 콘 드리 아, 그리고 핵 시각화를 인간의 피부 생 검으로 여러 신호 동시 라벨에 대 한 수 있습니다. 96 잘 접시 immunohistochemistry 절차의 단계를 구성 하는 편리한 방법입니다. 그림 1 는이 구성 계정에 대 한 솔루?…

Discussion

이 프로토콜은 분리, 계량 및 크기와 인간의 피부 생 검에서 3d에서 IENFs 내 신경 특정 미토 콘 드리 아의 분포 분석 설계 되었습니다. 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 부동성 형광 immunohistochemistry는 얼룩 답사 연구44,45에 대 한 다양 한 방법론을 제공 하는 각 샘플에서 여러 신호를 분석 하 고 설계 되었습니다. 이 절차는 confocal 현미경 이미지 및…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품 신경과 연구는 프로그램 NS061039 01A2 건강 보조금 K08의 국가 학회에 의해 지원 되었다 & 발견, 그리고 미시간 대학에서 A. Alfred Taubman 의료 연구 연구소. 이 작품은 형태학 및 이미지 분석 핵심 미시간 당뇨병 연구 센터, 국립 연구소의 당뇨병과 소화와 신 장병에서 5 P 90 DK-20572 건강 그랜트의 국가 학회에 의해 투자의 사용. 저자는 인간의 피부 샘플의 그들의 관대 한 기부에 대 한 제이 로빈슨 싱글톤과 A. 고 든 스미스 (유타 대학) 감사 하 고 싶습니다.

Materials

2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1X PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA
MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal

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