Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos
Özet
We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.
Abstract
During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.
Introduction
Os adenovírus contêm um genoma de ADN de cadeia dupla que replicam no núcleo da célula infectada. Quando o ADN virai entra no núcleo, que se localiza junto a PML corpos nucleares 1. Após expressão do gene precoce viral, a arquitetura nuclear é reorganizada de forma dramática, induzindo a formação de microambientes virais, denominado de Compartimentos replicação viral (RC) 2. Desde adenovirus (Ad) RC são os locais onde a replicação viral genoma e expressão de genes virais final têm lugar, eles fornecem um ambiente para o recrutamento de todos os fatores virais e celulares necessários que participam nestes processos. Curiosamente, uma variedade de proteínas celulares responsáveis pela resposta antiviral celular, tais como a resposta a danos no ADN, a resposta imune inata e supressão tumoral são co-optou por esses sítios virais 2. Cubos reguladoras Assim, Ad RC pode ser considerado que promovem a replicação viral eficiente enquanto concomitantemente regulação doresposta antiviral celular, indicando que estas estruturas são fundamentais para a compreensão das interacções vírus-hospedeiro de células. No entanto, os mecanismos moleculares da formação de RC, a sua composição e as suas actividades são mal compreendidos.
RC adenoviral, bem como RC de outros vírus de ADN que se replicam no núcleo não estão associadas a membranas, em contraste com RC citoplasmática 3. Além disso, estas estruturas induzida por vírus são susceptíveis de ser inteiramente constituída por proteínas e ácidos nucleicos. RC formado nas células infectadas com os vírus de ARN (usualmente denominado fábricas virais) foram isolados, aproveitando a sua localização citoplásmica e ligada à membrana de estado, o que facilitou a sua morfológica detalhada, a caracterização funcional e bioquímica 4.
Para nosso conhecimento, RC viral nuclear não tenham sido isolados, talvez devido à complexidade da arquitectura nuclear e ausência de m intranuclearesembranes que facilitem o seu isolamento. O estudo se baseou em vez de microscopia de imunofluorescência, FISH e microscopia eletrônica de transmissão. No entanto, apesar de complicações inerentes a isolar estruturas subnucleares, outros domínios nucleares, tais como nucléolos e Corpos de Cajal foram isoladas antes de 5,6. Desde nucléolos e Rc são ambas compostas de proteínas e ácidos nucleicos, e tem um diâmetro entre 0,5 – 5 mm, a hipótese de que RC também devem ser passíveis de isolamento. Por conseguinte, a fim de caracterizar mais precisamente a composição molecular e funções associadas a RC, foi estabelecido um novo método para isolar fracções enriquecidas com subnucleares RC. Para este fim, preparado de fracções sub-nuclear utilizando gradientes de velocidade e almofadas de sucrose semelhantes aos procedimentos usados para isolar nucléolos 7 ou outros domínios nucleares 6 e estabelecido um sistema isento de células, que permite o estudo da composição molecular e de actividades associadasRC. Essa técnica deve, portanto, fazer avançar a compreensão das interações celulares vírus-hospedeiro e representa uma ferramenta poderosa que devem também facilitar a análise detalhada de RC de outros vírus que se replicam no núcleo e induzir a formação de compartimentos de replicação de dimensões semelhantes às formada em adenovirus- As células infectadas, tais como, vírus do herpes, vírus de papiloma ou poliomavírus.
Protocol
Representative Results
Discussion
In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) and Promep-SEP for R.A.G.; P.H. received a scholarship from CONACyT (447442).
Materials
| DMEM | Gibco | 12100-046 | Warm in 37 ºC water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12484-028 | |
| Sucrose, Ultra Pure | Research Organics | 0928S | Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC |
| Dounce homogenizer | Kontess Glass Company | 884900-0000 | |
| Branson 1800 Ultrasonic Bath | Branson | Z769533 SIGMA | Turn on 15 min before use. |
| Peroxidase AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-036-003 | Use at a 1:10,000 dilution in PBS/0.03% non-fat milk |
| Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21121 | Use at a 1:2,000 dilution in PBS |
| Silane-Prep Slides | Sigma | S4651-72EA | Open in a laminar flow cabinet |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce ThermoScientific | 34080 |
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