Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

Aaron J. Clark; Shayan Fakurnejad; Quanhong Ma; Rintaro Hashizume

doi:10.3791/53287

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Tıp

Biolumineszenz-Bildgebung von einem immunkompetenten Tiermodell für Glioblastoma

Published: January 15, 2016

doi:

10.3791/53287

Aaron J. Clark¹, Shayan Fakurnejad², Quanhong Ma², Rintaro Hashizume^2,3

¹Department of Neurological Surgery,University of California San Francisco, ²Department of Neurological Surgery,Northwestern University Feinberg School of Medicine, ³Biochemistry and Molecular Genetics,Northwestern University Feinberg School of Medicine

Özet

GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

Abstract

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.

Introduction

Malignant glioma is the most common and most lethal human brain tumor. Even when treated with maximal surgical resection, radiotherapy, and chemotherapy, median survival remains 15-20 months at major brain tumor referral centers^{1, 2, 3}. The most aggressive form of malignant glioma, glioblastoma, is characterized by mitotic figures, neovascularization, invasion into adjacent brain, and pseudopalisading necrosis. Orthotopic brain tumor xenografts using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research and facilitated pre-clinical translation for testing of new agents, prior to entry into human clinical trials. Whereas most of human xenograft models recapitulate many features of the human disease, a fundamental limitation with all human-based xenograft model systems is the use of immunodeficient animals⁴.

The absence of an intact host response clearly modifies tumor growth both in terms of tumor morphology, and efficiency of engraftment. While certain assumptions are acceptable in the interpretation of results from xenografted models, achieving relevant conclusions in the area of therapeutic assessment is a challenge. Certain fundamental biologic features are likely to be similar in immunodeficient and immunocompetent animals, but others such as tumor associated inflammation, tissue invasion, response to injury are probably very different. In contrast, GL261 is a chemically induced murine glioma cell line that accurately recapitulates glioma when implanted into the brains of immunocompetent syngeneic C57BL/6 mice⁵. Similar to the human disease, intracranial tumor growth rapidly and reproducibly leads to neurologic symptoms and animal demise^6-10.

Subcutaneous tumor growth can be directly measured. Intracranial tumor growth can only be measured with animal sacrifice or with costly imaging studies. Stable expression of the enzyme luciferase allows non-invasive and cost-effective intracranial bioluminescence imaging¹¹. Bioluminescence of luciferase transfected GL261 cells correlates well with intracranial tumor growth. We have recently directly compared GL261 to luciferase modified GL261 cells and demonstrated no difference in in vitro growth and invasion, immunologic cytokine profile, in vivo survival of intracranial tumor bearing C57BL/6 mice, or immune cell infiltrate. This technique is applicable to glioblastoma preclinical studies which involve non-invasive monitoring of tumor growth.

Protocol

Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren wurden überprüft und von der Institutional Animal Benutzung und Pflege Ausschuss der Northwestern University genehmigt und unter sterilen Bedingungen durchgeführt. 1. Änderung des GL261 Zellen mit Glühwürmchen-Luciferase-Reporter mit dem Ausdruck Hinweis: HIV-1-basierten lentiviralen Vektoren exprimieren Glühwürmchenluciferase (Fluc) unter der Steuerung der Milz Fokus-bildende Virus (SFFV) -Promotor. Die optische Reportergens in das Vektorplasmid pHRSIN-CSGW-dlNotI kloniert. Aufrechtzuerhalten 293-T-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und GL261-Zellen in RPMI-Medium mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin ergänzt bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre, die 95 % Luft und 5% Kohlendioxid (CO 2). Wenn die 293-T-Zellkultur erreicht 80% Konfluenz in einem T-75-Kolben, die Zellen werden einmal mit phosphate Pufferlösung (PBS), ohne Ca2 + und Mg2 +, Inkubation der Zellen mit 3 ml Trypsin (0,05%) bei 37 ° C für 5 min, verreiben mit einer 5 ml Pipette, indem der Kolben leicht schräg und sammeln Sie alle Zellen von der Unterseite des Kolbens. Übertragen Sie die 3 ml Trypsin Zellsuspension in ein 15 ml konischen Rohr und 7 ml Fleisch RPMI-Medium (insgesamt 10 ml der Zellsuspension). Mischen Sie die Zellsuspension gut mit einer 5 ml Pipette. Nehmen Sie 100 & mgr; l der Zellsuspension aus dem Rohr und die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer. Um dies zu tun, mischen Sie 100 ul der Zellsuspension mit 300 ul Trypanblau-Lösung und legen Sie 2 ul der Mischung in einem Hämocytometer. Zählen Sie die Anzahl der Zellen, ohne Blaufärbung aus vier separaten Ansichten unter dem Mikroskop. Der Mittelwert der Zellzahl von jedem Blick, da diese Zahl repräsentieren 10 4 Zellen / ml. In der Zwischenzeit, zentrifugieren Sie das Röhrchen mit der Zellsuspension bei 300 · g für 7 min. Saugen Sie das Medium und Zellpellets mit frischem RPMI-Medium, eine GL261 Zellsuspension bei Dichte von 1,0 x 10 6 / ml zu machen. Samen 2,5 x 10 6 GL261-Zellen mit 2,5 ml RPMI-Medium in einer T-175-Kolben mit 27,5 ml DMEM (Tag 1). Nach 24 Stunden, ersetzen Sie das Medium, das mit 20 ml frischem DMEM (Tag 2). Zur Herstellung des lentiviralen Vektors, Mix 54 ul Transfektionsreagenz mit 2 ml serumfreiem DMEM für 5 min. In 3 ug gag-pol, 3 ug Virus der vesikulären Stomatitis G Hülle (VSV-G) und 4,5 ug des Fluc (pSIN-Fluc) in den DMEM mit Transfektionsreagenz, und Inkubation für 20 min bei RT. Fallen die gesamte DNA-Gemisch in 293-T-Kolben (T-175) und bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer mit 95% Luft und 5% CO 2 für 48 Stunden (Tag 2). 10 ml frisches DMEM bei 24 Stunden nach der Transfektion (Tag 3) (Gesamtvolumen von 293-T-Zellkulturmedium sollte ungefähr 30 ml betragen). Um GL261 Zellen in einem Split24-Well-Platte, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS ohne Ca2 + und Mg2 +, Inkubation der Zellen mit 5 ml Trypsin (0,05%) bei 37 ° C für 5 min, verreiben mit einer 5 ml Pipette, indem Sie den Kolben leicht schräg , sammeln Sie alle Zellen, die von der Unterseite der Flasche, und zählen Zellen über Hämozytometer wie in Schritt 1.2. In der Zwischenzeit, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 g für 7 min. Saugen Sie das Medium und Zellpellets mit frischem RPMI-Medium, eine GL261 Zellsuspension bei Dichte von 2,5 x 10 4 / ml zu machen. Samen 2,5 x 10 4 GL261-Zellen mit 1 ml RPMI-Medium in einer 24-Well-Platte (Tag 3). Sammeln 30 ml des lentiviralen Stand mit 10 ml Pipette aus der 293-T-Kolben (T-175) bei 48 h nach der Transfektion und den Überstand in 50 ml konischen Röhrchen. Absaugen 30 ml lentiviralen Stand über eine 50 ml Spritze durch ein 0,22 um-Spritzenfilter und Aliquots der Virusüberstand in 1 ml Aliquoten (Tag 4). Ersetzen Sie die 1 ml RPMI mittel GL261 Zellenplatte (24 Vertiefungen) mit 1 ml des lentiviralen Stand und bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer (Tag 4). Nach 48 Stunden der lentiviralen Infektion, ersetzen Sie das Medium mit 1 ml frisches RPMI (Tag 6). Nach 24 Stunden, wiederholen Sie den lentiviralen Infektion der GL261 Zellen (Tag 7). Nach dem 2. 48 h lentiviralen Infektion, ersetzen Sie das Medium mit 1 ml frisches RPMI (Tag 9). Weiterhin die Luciferase modifiziert GL261 Zellen wachsen (im folgenden als GL261.luc Zellen bezeichnet werden) und erweitern Sie die Zellkultur mit einem T-75-Kolben. Wenn die GL261.luc Zellkultur erreicht 70% Konfluenz in einem T-75-Kolben, Ernte der Zellen durch Trypsinisierung und zählen durch Hämocytometer wie in Schritt 1.2. Plate Die GL261.luc Zelle in eine 24-Well-Platte bei Abschluss Dichten (1,0 x 10 6, 5,0 × 10 5, 2,5 × 10 5, 1,0 × 10 5, 5,0 × 10 4, 2,5 × 10 4 Zellen / Vertiefung) und Inkubieren bei 37 ° C in einem befeuchtetenfied Kammer, die 95% Luft und 5% CO 2 für 3 Stunden. Zell Luciferaseaktivität relatives Maß modifiziert U-87 MG (U87.luc) Zellen unter Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung (1) Luciferase. Starten Sie das Software-Image (klicken Sie auf das Symbol auf dem Desktop) und initialisieren Sie den Imaging-System (klicken Sie auf "Initialisieren" drücken). Die Initialisierung beginnt automatisch und kann einige Minuten für das System-Check-up und der Kamera auf -90 ° C abgekühlt werden. In 25 ul Luciferin (D-Luciferin Kaliumsalz, 150 mg / kg) in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen mit Luciferin für 1 min bei RT und Bild die Platte für 10 Sekunden. So richten Sie das Abbildungssystem, wählen Sie "Leuchtende", "10 sec" Belichtungszeit, und "Medium" Binning. Legen Sie die Platte mit 24 Vertiefungen auf der Abbildungsstation und klicken Sie auf die Schaltfläche "Aufnahme" um Bild zu starten. Nachdem das Bild erfolgreich erworben wird, werden Sie ein Bildfenster und Werkzeug pa zu sehenlette auf dem Bildschirm. Klicken Sie auf "ROI (Regions of Interest) Tools" und wählen Sie 6 x 4 aus dem Schlitz-Symbol. Erstellen Sie 6 x 4 Schlitze, um den Bereich des Signals auf das Bild der 24-Well-Platte abdecken und auf die Registerkarte Messungen (Bleistiftsymbol). Beachten Sie ein Fenster mit einer Tabelle der ROI-Messungen als Einheit der Photonen pro Sekunde pro Steradiant pro Quadratzentimeter (Photonen / sec / sr / cm 2). Verwendung U87.luc Zellen, die zuvor mit dem gleichen Lentivirus für GL261 Modifikation 11 hier verwendeten modifizierten, als Kontrolle für die Bewertung der Luciferase-Aktivität in transduzierten Zellen GL261.luc. 2. In-vitro-Proliferationstest Wenn die GL261 und GL261.luc Zellkulturen erreicht 70% Konfluenz in einem T-75-Kolben, Ernte der beiden Zellinien durch Trypsinisierung und zu zählen, wie in Schritt 1.2 und Platten Zellen in eine Platte mit 96 Vertiefungen in einer Dichte von 1500 Zellen in 80 ul RPMI-Medium pro Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette, um Zeit und Pipettieren Fehler zu minimieren. Seed jede Zelllinie in 20 Bohrlöchern insgesamt. Um die Verdampfung in den Vertiefungen von Zellen besiedelt zu begrenzen, füllen leere Brunnen mit 100 ul frisches RPMI-Medium. Beurteilen Sie die Zellproliferation unter Verwendung eines kolorimetrischen Zellproliferationstest. Hier verwenden wir die MTS-Zellproliferationstest. Verwendung einer Mehrkanalpipette je 20 ul MTS-Reagens in jede Vertiefung der 96-Well-Platte, die Zellen enthält. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer mit 95% Luft und 5% CO 2 für 3 Stunden. Messung der Extinktion bei 490 nm mit einem Mikroplatten-Reader. Dies wird an den Tagen 1, 2, 4 wiederholt, und 7 nach der Plattierung. Um Extinktionswerte zu normalisieren, werden die Werte jedes Tages durch die entsprechenden Messwerte am Tag 1 (Figur 2) erhalten unterteilt. 3. Implantation der Tumorzellen Hinweis: druck alle Geräte. Bereiten Operationsgebiet durch Aufsprühen einer Desinfektionsmittel (2% Chlorhexidin-Lösung) und Abdeckung mit absorbent Vorhänge. Um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, während der Operation zu tragen sterile Handschuhe, und teilen den OP-Bereich in zwei Bereiche durch Farbband. Area 1 "sauber" ist markiert und enthält sterilisiert und Betriebsstoffen; Area 2 ist "Dirty" gekennzeichnet und enthält verwendeten Materialien. Vor der Tierchirurgie, bereiten eine Zellsuspension für intrakranielle Injektion. Ernten der Zellen aus einer 70% konfluenten T-75-Kolben durch Trypsinisierung und zählen Zellen mittels Hämozytometer wie in Schritt 1.2, und eine Zellsuspension in einer Dichte von 1,0 x 10 5 Zellen / & mgr; l in Hanks 'Balanced Salt Solution ohne Ca 2+ und Mg 2+ (HBSS). Betäuben Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von 200 ul Mischung, die 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin in 0,9% Kochsalzlösung. Um eine ordnungsgemäße Betäubung bestätigen, kneifen die Zehe der Maus. Wenn die Maus komplett in Narkose, sollte die Maus nicht auf den Reiz zu reagieren. Verwalten 0,1 mg / kg Buprenorphin subkutane Injektion, um die postoperativen Schmerzen zu lindern. Rasieren Sie die Oberseite des Kopfes der Tiere unter Verwendung von Schneidemaschinen und sauber und mit einer Baumwollspitze Applikator in 2% Chlorhexidin-Lösung eingetaucht. Bewerben Augensalbe, um eine ausreichende Schmierung während der Operation zu erhalten. Machen Sie eine sagittale Inzision ca. 1 cm lang über die parietooccipitalis Knochen mit einem sterilen Skalpell. Um das Bregma visualisieren, wischen Sie die Oberfläche des Schädels mit einem Baumwoll-Spitze-Applikator in einer 3% igen Wasserstoffperoxid-Lösung getränkt. Bohren Sie den Schädel mit einer sterilen 25-G-Nadel ein kleines Loch 3 mm auf der rechten Seite des Bregma und direkt hinter der Kranznaht zu machen. Um sicherzustellen, dass intrakraniellen Injektionsstelle ist bis zu einer Tiefe von 3 mm aus dem Schädel, schneiden 3 mm aus dem spitzen Ende eines 20 ul Pipettenspitze mit einer Schere und legen Sie eine Spritze in die Pipettenspitze. Legen Sie die Spritze senkrecht zu der zuvor erstellten Loch, und langsam injizieren die Tumorzelle susRenten, die 3,0 x 10 5 Zellen in 3 ul HBSS, die über einen 1-minütigen Zeitraum. Lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle für eine weitere Minute, und dann langsam die Nadel herausziehen. Wischen Sie die Schädel mit Baumwoll-Spitze-Applikator in 3% Wasserstoffperoxid eingetaucht und der 2% Chlorhexidin-Lösung. Trocknen Sie die Oberfläche des Schädels mit dem Baumwoll-Spitze-Applikator. Schneiden Sie die sterile Knochenwachs etwa 3 mm 3 in der Größe und befestigen Sie das Knochenwachs auf der Stirnseite des Baumwoll-Spitze-Applikator. Übernehmen Sie die Knochenwachs, um das Loch mit dem Baumwoll-Spitze-Applikator zu decken. Ziehen die auf jeder Seite der Kopfhaut zusammen über den Schädel mit einer Pinzette und Stapel, um die Wunde zu schließen. Reinigen Sie die Wunde mit einer Baumwollspitze in 2% Chlorhexidin-Lösung eingetaucht. Überwachen Sie alle Mäuse nach der Operation, bis sie ambulant zu werden und zu halten normale Aktivität. Typischerweise ist Erholungszeit ca. 30 min. Die Mäuse in den Käfig mit anderen Tieren nicht zurückgeben, bis sie vollständig aus der Narkose erholt. <p class = "jove_title"> 4. Biolumineszenz-Bildgebung des GL261 Tumorwachstum Sprühen Sie eine großzügige Menge an Desinfektionsmittel (0,05% Dimethyl-Ammoniumchlorid-Lösung) auf einem sauberen Papiertuch. Verwenden Sie das Desinfektionsmittel getränkten Papiertuch gründlich wischen Sie das schwarze Blatt, Nase Kegel und Teiler innerhalb des Abbildungskammer, in der die Tiere in Kontakt mit dem Gerät sein. Wischen Sie alle Oberflächen mit einem sauberen, trockenen Papiertuch. Wiederholen Sie diese noch einmal und warten Sie 5 Minuten. Initialisieren Sie die Abbildungsstation, wie in Schritt 1.14.1. Betäuben die Maus mit einer 300 ul-Mischung, enthaltend 200 ul Ketamin / Xylazin und 100 ul Luciferin (D-Luciferin-Kaliumsalz, 150 mg / kg) durch intraperitoneale Injektion. Warten Sie 10 Minuten nach der Injektion ein und bestätigen Sie, wenn die Mäuse sind völlig unter Narkose durch Einklemmen des Schwanzes. So richten Sie das Abbildungssystem, wählen Sie "Leuchtende", "Auto" Belichtungszeit, und "Medium" Binning. Platzieren Sie die Maus auf dem Imaging-statiauf und klicken Sie auf die Schaltfläche "Aufnahme" um Bild zu starten. Sicherzustellen, dass die Zeit nach der Injektion ist konsistent mit jeder Bildgebungssitzung. Nachdem das Bild erfolgreich erworben wird, sollte ein Bildfenster und Werkzeugpalette angezeigt. Klicken Sie auf "ROI Tools" und wählen Sie "Auto" aus dem Kreissymbol. Um ROIs definieren, umgeben den Bereich des Signals auf das Bild, und dann nehmen Sie Messungen der ROI als Einheit von Photonen / sec / sr / cm 2. Nehmen Sie die Mäuse aus dem Imaging-Kammer und überwachen die Mäuse bis sie ambulant zu werden und zu halten normale Aktivität. Typischerweise Wiederherstellungszeit beträgt ca. 15 min. Die Mäuse in den Käfig mit anderen Tieren nicht zurückgeben, bis sie vollständig aus der Narkose erholt. Überwachen Sie das Tumorwachstum durch Biolumineszenz-Bildgebung zweimal pro Woche, bis Tiere präsentieren die folgenden Symptome: Gewichtsverlust (Verlust von mehr als 20% bezogen auf das Gewicht vor der Implantation), Appetitlosigkeit (Anorexie komplette 24 h), und der Mangel an nachhaltigen purposeful Reaktion auf sanfte Reize (schwachen Versuch, aufzustehen), zu welchem Zeitpunkt sie eingeschläfert werden sollte. Euthanize Tiere mit diesen Symptomen unter Verwendung eines CO 2 Kammer durch Genickbruch folgte. Platz Mäusen in die Euthanasie Kammer (nicht überfüllt die Kammer) und Zulaufdruck CO 2 für 5-6 min. Beachten Sie, dass alle Tiere Bewusstlosigkeit und nicht nach ca. 5 min Atem sind. Nehmen Sie die Mäuse aus der Kammer. Stellen Sie sicher, dass das Herz nicht durch das Gefühl der Brust zwischen Daumen und Zeigefinger zu schlagen und zu überprüfen, dass es keine Blinkreflex. Restrain die Maus in Bauchlage auf einer ebenen Fläche und fassen Sie die Rückseite des Halses an der Basis des Schädels mit einer Hand und Basis des Schwanzes mit Ihrem Daumen und Zeigefinger der anderen Hand. Restrain den Kopf und den Schwanz schnell ziehen nach hinten. Stellen Sie sicher, dass Schädel wird aus dem ersten Halswirbel mit Ihrem Daumen und Zeigefinger getrennt. Normalize Helligkeitswerten für jeden Tag, an entsprechenden Messwerte am ersten Tag des Biolumineszenz-Bildgebung, wie in Schritt 2.3 (3A) erhalten wird. Für die statistische Analyse zu generieren Lebenskurven mit Hilfe der Kaplan-Meier-Schätzer 12 und vergleichen Sie die Unterschiede zwischen den Überlebenskurven unter Verwendung eines Log-Rank-Test 13.

Representative Results

GL261-Zellen wurden mit Luciferase enthält Lentivirus, wie oben in den Schritten 1. In vitro Biolumineszenz-Bildgebung zeigt robust Luciferaseexpression ähnlich Ebenen in der Positivkontrolle U87.luc menschliche Glioblastomzelllinie (1) infiziert. Wie erwartet, nicht infizierten GL261 Zellen zeigen keinen Hintergrund Luciferase-Expression. Dieser Schritt ist einfach, aber wichtig, vor der weiteren Untersuchungen mit Hilfe der infizierten Zelllinie, um eine stabile Luciferase-Expression zu bestätigen durchzuführen. Luciferase-Expression nach der intrakraniellen Implantation. Vor intrakraniale Implantierung demonstrierten wir keinen Unterschied in vitro Wachstum von GL261.luc Vergleich zu GL261-Zellen (Abbildung 2). Für intrakraniellen Wachstum und Überleben-Analyse wurden die Zellen in das br injiziertains von C57BL / 6 Mäusen laut Protokoll Schritt 3 Das Tumorwachstum in Mäusen mit Tumoren GL261.luc wurde seriell für Biolumineszenz-Bildgebung untersucht mit Protokollschritt 4 und zeigten nachweisbare Tumorwachstum (3A). Mäusen mit Tumoren GL261.luc schnell und konsequent wurde moribund und wurden getötet. Wichtiger ist, es gibt keinen Unterschied in der Überlebens zwischen GL261.luc und GL261 Tumor tragenden Tieren (3B). In vivo Biolumineszenz-Bildgebung kann daher verwendet werden, um als Reaktion auf Versuchs Glioblastom Behandlungen zu überwachen. Schnelle zuverlässige Tumorwachstum und kurze Überlebenszeit kann große Datenmengen in einer relativ kurzen Zeitdauer zu erhalten. Abbildung 1. Die Luciferase-Aktivität in Zellen GL261.luc. U87.luc, GL261.luc und GL261 (negative Kontrolle) Zellen wurden bei Dichten von plattierten1,0 x 10 6, 5,0 × 10 5, 2,5 × 10 5, 1,0 × 10 5, 5,0 × 10 4 und 2,5 x 10 4 Zellen / Vertiefung von links nach rechts. Lumineszenz (Photonen / sec / sr / cm 2) wurde durch die Lumina Abbildungsstation gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2. Die Luciferase-Expression beeinflusst nicht GL261 Zellproliferation. GL261.luc Zellen nicht verursachen ein Differenz Proliferation von MTS-Zellproliferationstest demonstriert. Der Graph zeigt fache Zunahme im Vergleich zu Tag 1, wie durch einen Vergleich des mittleren Absorptionswert (Mittelwert ± SEM) bei den spezifizierten Zeitpunkt auf den Mittelwert am Tag 1 (ungepaarter t-Test Werte für Vergleichezwischen den einzelnen Zelllinie: P = 0,7796) 14. Fehlerbalken stellen die Durchschnittswerte (Mittelwert ± SEM) von Vierfachproben an jedem Tag. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3. Die Luciferaseexpression Dosis nicht Einfluss auf in vivo Tumorwachstum und das Überleben der Tiere. (A) Biolumineszenz Überwachung zeigt progressive Wachstum von intrakraniellen GL261.luc Tumor in C57BL / 6 Mäusen. (B) Kaplan-Meier-Überlebensanalyse zeigt keinen Unterschied im Gesamtüberleben für Mäuse intrakranial entweder mit GL261 (durchgezogene Linie) oder GL261.luc Zellen implantiert (gestrichelte Linie).Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

GL261 murine Gliomzellen bei intrakranial in syngene immun C57BL / 6-Mäuse implantiert, im Vergleich zu humanen Gliom Xenotransplantat Tiermodelle bieten mehrere Vorteile. Viele xenografted Tumoren wachsen als gekapselte Läsionen, die nicht exakt zu rekapitulieren Sie die invasive Erkrankungen des Menschen. Im Gegensatz dazu GL261 Tumor zeigt nicht nur Invasion in benachbarte Gehirn, sondern auch Gefäßneubildung, Mitosen und tiefe Nekrose ^7. Am wichtigsten bei der Untersuchung der Tumorimmunologie oder immuntherapeutischen Strategien ^{15, 16,} die C57BL / 6-Maus, behält ein intaktes Immunsystem ^8. Frühere Studien haben robuste Ausdruck der immunsuppressiven Zytokin TGF-β gezeigt und intrakranielle Tumoren Immunsuppressiva ähnlich dem menschlichen Glioblastom ^{9, 10} T-regulatorischen Zellen enthalten.

Die hier beschriebene einfache Technik ermöglicht eine stabile Expression von Luciferase von GL261 Zellen. Wir haben vor kurzem berichtet, SimiLAR in vitro und in vivo-Wachstum von GL261.luc Zellen im Vergleich zu Zellen, GL261, zusätzlich zu ähnlichen Tumor histologischen Merkmale und Immun Zellinfiltrat ^17. GL261.luc Zellen exprimieren stabil Luciferase, die die Oxidation des Substrats Luciferin Umwandlung chemischer Energie in Photonen und daher detektierbar Licht katalysiert. Luciferin kann sicher an Tiere verabreicht werden kann und durch die Blut-Hirn-Schranke nach intraperitonealer oder intravenöser Injektion. In kleinen Versuchstiere wie Mäuse, kann die Biolumineszenz von außen in einer nicht-invasiven Weise ¹¹ detektiert werden. Daher kann das Tumorwachstum in Reihe ohne die Notwendigkeit für Tieropfer oder kostspielig MRI oder CT-Bildgebung zu beurteilen.

Die kritischen Schritte in dem Protokoll beinhalten, nicht nur die lentivirale Transduktion, sondern auch die Überprüfung der stabilen Expression von Luciferase in vitro vor dem Beginn einer in vivo Experimenten. Verlust der Transduktion kann requiWiederwiederholungs Lentivirus-Infektion. Einführung einer Antibiotikaresistenz-Gen in den Expressionsvektor kann auch verwendet werden, um die Luciferase-Expression aus. Sorgfältige Technik wird für intrakraniale Implantierung erforderlich reproduzierbar einer kohärenten Anzahl von Zellen in einer genauen anatomischen Ort zum Vergleich der verschiedenen Behandlungsgruppen zu ermöglichen. Ein wesentlicher Unterschied zwischen der aktuellen Studie und früheren Studien Luciferase GL261-Zellen, ist die Verwendung einer Freihandtechnik zur Implantation Zellen im Vergleich zu der Verwendung eines stereotaktischen Rahmens ^18. Wir haben bereits gezeigt, konsistente Ergebnisse der Implantation mit der freien Hand Technik ^19. Der Vorteil der freien Hand Technik ist die Fähigkeit, eine hohe Durchsatzanalysen verschiedener Behandlungsmittel durchzuführen. In unseren Händen können wir ca. 60 Tiere in 1 Stunde zu implantieren.

Nachdem die Beherrschung der Technik, die zukünftige Anwendungen dieser Technik sind grenzenlos. Wie GL261 demonstrAtes erhöhten Mitosen und schnellen Tumorwachstum ähnlich dem menschlichen Glioblastom, können anti-proliferative Behandlungen ausgewertet werden. In ähnlicher Weise können anti-invasive und anti-angiogenen Therapien eingesetzt werden, da die GL261 Tumoren invasiv und angiogene sind. Bei der Beurteilung der Wirkung von Chemotherapeutika auf menschliche Ziele ausgerichtet ist Vorsicht geboten. Im Vergleich zu früheren Studien mit humanen Glioblastom Xenotransplantate ^{Luciferase-20} exprimieren, würde dies als eine Beschränkung unseres Modells werden. Auch kann die Wirkung der immuntherapeutischen Strategien des Tumorwachstums in dem GL261-Xenotransplantat-Modell untersucht werden.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Rajwant Kaur for technical assistance. We would like to thank Maxwell Tom for assistance with lentivirus preparation. This work was supported by the Reza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgery at UCSF, and the Michael J. Marchese Professor and Chair at Northwestern University.

Materials

D-Luciferin, Potassium Salt	Gold Biotechonology	LUCK-100	Store away from light
Living Image Software	Caliper Life Sciences	Contact for Quote	none
Xenogen Lumina	Caliper Life Sciences	Contact for Quote	none
24-well; Standard tissue culture; flat-bottom	Falcon	353047
CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	G3582	none
Synergy 2 Multi-Mode Reader	BioTek	Contact for Quote	none
96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed	Coster	3603	none
Ketaset	Pfizer	NDC 0856-2013-01	Control substance
Xylazine	Sigma-Aldrich	23076-35-9	none
28G Needle (with syringe)	Fisher	22-004-270	AKA Insulin Syringe
2% Chlorhexidine	Fisher	NC9756995	AKA “Nolvasan”
3% Hydrogen Peroxide	Fisher	H312P-4	Store away from light
Ophthalmic Ointment	Cardinal Health	1272830	AKA “Akwa Tears”
25G 1 1/2 needle	BD Becton Dickinson	305127	none
Disposable Scalpels	Feather	2975	No. 21
Gauze	Fisher	22028563	Autoclave before use
Heating Pad	Dunlap	HP950	none
Skin Stapler, Staples, Remover	Stoelting	59020	none
PDI Alchol Prep Pads	Fisher	23-501-711	none
Reflex 7mm Wound Clips 100 pack	Brain Tree Scientific, INC	203 1000	Autoclave before use
Reflex 7mm Wound Clip Applier	Brain Tree Scientific, INC	204 1000	Autoclave before use
Reflex 7mm Wound Clip Remover	Brain Tree Scientific, INC	205 1000	none
Single Ended Round Tip Swab with Wood handle	Qosmedix	10107	Autoclave before use
Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS)	Gibco	14170-112	none
Hamilton Syringe	Hamilton	80300	none
FuGENE 6 Transfection Reagent	Promega	E2961	none
Bone Wax	Harvard Apparatus	599864	none

Referanslar

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Bioluminescence Imaging Immunocompetent Animal Model Glioblastoma GL261 Murine Tumor Cells Luciferase Modification Tumor Cell Proliferation In Vivo Monitoring Tumor Growth Immunotherapy In Vitro Proliferation Assay MTS Reagent Absorbance Measurement

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Clark, A. J., Fakurnejad, S., Ma, Q., Hashizume, R. Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (107), e53287, doi:10.3791/53287 (2016).