La cuantificación de la madre del colon mutaciones celulares

Se cree que el cáncer de colon de involucrar a la exposición a los agentes ambientales y componentes de la dieta que pueden dañar el ADN y producir la activación de mutaciones somáticas en oncogenes (por ejemplo, ß-catenina) o inactivación de las mutaciones en los genes supresores de tumores (por ejemplo, APC). Se supone que estas mutaciones se producen críticos en las células madre del colon. Debido a la arquitectura única de la cripta epitelio del colon, es posible medir las mutaciones de células madre en el colon después de exponer a los animales a los productos químicos asociados con la carcinogénesis de colon. Varias enzimas ligadas al cromosoma X pueden servir como indicadores para las mutaciones que se producen en las células madre, ya que las mutaciones estarán presentes en todas las células dentro de una cripta.

Anteriormente, un procedimiento se publicó que demuestra que los productos químicos que inducen tumores de colon en ratones también generaron mutaciones de células madre somáticas en el colon a través de análisis de mutaciones en el nivel de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ligada al cromosoma X gen (G6PD) ^1-3.El método cuantifica la incidencia de mutaciones somáticas aleatorias en las células madre del colon sin ninguna presión de selección. El procedimiento implica la producción de secciones de colon no fijadas congelados procedentes de ratones tratados y de control y la identificación de criptas desprovistas de células que producen la actividad G6PD funcional. Estas criptas mutados, que aparecen blanco, indican que la mutación se produjo en una célula madre que dio origen a la progenie también alberga un gen G6PD mutado. En el ensayo enzimático, criptas G6PD mutante deficiente no pueden oxidar la glucosa-6-fosfato, que se requiere para la reducción de nitro azul tetrazolio (NBT). Cuando la enzima G6PD es funcional, el NBT en la mezcla de tinción se reduce a formazán insoluble y precipita, acumulando en la ubicación de la enzima y células "de tinción" azules. Las células que son mutantes de G6PD permanecen blanquecino en contraste con azul manchadas criptas de tipo salvaje. Este método mide mutaciones que tienen un fenotipo "nulo". Debido a que enenzimas, tales como G6PD, puede difundirse fuera de las células en una sección de tejido no fijado si las secciones se colocan en una solución acuosa, es necesario para estabilizar la enzima en las secciones de tejido a analizar. ⁴ La estabilización de la enzima en el tejido no debe interferir con la difusión de pequeñas moléculas de reactivo necesario para la reacción enzimática G6PD.

Hemos hecho una serie de cambios significativos en el procedimiento original. El medio para la tinción enzimática crítica ha sido cambiado de alcohol de polivinilo a Optimal Compuesto Temperatura de corte (OCT), lo que facilita el control del pH y la solubilización de los componentes utilizados en el ensayo. La tinción se realiza usando 0,4 – 0,5 ml pozos hechos de arandelas de acero de manera que cada sección de tejido recibió el mismo volumen de la mezcla de reacción G6PD. Se desarrolló un procedimiento para estimar el número de criptas en una sección fotografiado que proporciona una gran toma de muestras del tejido del colon sin tenerpara contar manualmente> 10 ⁵ criptas para cada colon. El análisis de los adyacentes 7 micras secciones de tejido permite la visualización de una cripta mutante en más de una diapositiva, lo que reduce los posibles artefactos de tinción. Estos cambios hacen que el procedimiento sea más eficiente y reproducible.

El uso de este protocolo revisado, hemos cuantificado la frecuencia de mutación en las células madre del colon después de la exposición de ratones C57BL / 6 a azoximetano, un carcinógeno bien conocido de colon en roedores ^5-7.