This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.
T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (µM range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on Förster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.
הבנה בסיסית יותר של איך תאי T מזהים אנטיגנים דורשת מחפשת במקום הנכון, כלומר, בתוך הסינפסה החיסונית נוצרה בין תאי T וAPC. כאן, קינטיקה מחייבת המולקולרית אינן נקבעת רק על ידי המאפיינים ביוכימיים הטבועים של שותפי האינטראקציה מעורבים אך תלויה במידה רבה בפרמטרים סלולריים, הכוללים כוחות סלולריים, ארכיטקטורת קרום ואינטראקציות בין חלבוני קרום לרוחב, כמו גם אילוצים גיאומטריים סינפסה הספציפית 3. גישות ביוכימיות מוגבלות בפתרון הכח כפי שהם מחייבים את השיבוש של לפחות אחד מהקרומים הסינפטי המעורבים. מסיבה זו מתודולוגיה הדמיה מבוססת סריג פותחה כדי לפקח מחייב של TCR לpMHCs אנטיגני 2. הנה תאי T מעוצבים עם רקומביננטי ואתר-במיוחד שכותרת בר נוגדני שרשרת אחת TCRβ-reactive (SCF V) והתעמתו עם תכנית bilayers AR-נתמך זכוכית שומנים (SLBs), שנמל מולקולות MHC בכיתה השני עמוסות פפטיד אנטיגני שכותרתו fluorescently, מולקולות costimulatory וחלבוני הדבקה. Synaptic מחייב בין תוצאות TCR ולצבוע כותרת שכותרתו צבע pMHC בסריג, אשר יכול להיות במעקב בתפזורת ורמת מולקולה בודדת על ידי הקרינה השתקפות הפנימית סה"כ מיקרוסקופיה (TIRF).
במאמר זה מוסבר בפירוט כיצד לנצל SLBs למנסה לאמוד סינפסות T-cell, לוודא תקינותם באמצעות assay סידן שטף T-cell פונקציונלי, התנהגות סריג מדידות בכמויות גדולה וברגישות מולקולה בודדת, ולנתח את הנתונים שנרכשו. המלצות מוצעות לייצור חלבונים תאמו כראוי נדרשים לfunctionalization bilayer. לקבלת מידע ספציפי יותר לגבי היווצרות bilayer והתקנה של מיקרוסקופ TIRF מתאים אנא פנה לפרסום יופיטר נוסף גישה ציבורית שפורסם גב אל גב 4.
אוהל "> טבע של SLBsSLBs Functionalizable יכול להיות שנוצר בקלות משלפוחית unilamellar (רכבי שטח) המכילה שני שומנים-2-oleoyl-SN-gylcero-3-phosphocholine 1-palmitoyl (קצר: POPC, 90-99%) וSN 1,2-dioleoyl- – glycero-3 – {[N (5-אמינו-1-carboxypentyl) iminodiacetic חומצה] succinyl} (קצר: DGS נת"ע-ניקל, 1-10%). רכבי שטח התפשטו על שקופיות זכוכית נקיות כדי ליצור bilayer מישוריים רציף 4. DGS-נת"ע-ניקל משמש לעגן חלבונים מתויג polyhistidine באמצעות מורכבת היווצרות תיווך polyhistidine עם קבוצת הראש (איור 1 א) נת"ע-Ni-המכיל הסינתטי. לעמותה יציבה אחד בדרך כלל מחליף את תחום הילידים הטרנסממברני וזנב cytoplasmic של חלבון ההידבקות ICAM-1 ומולקולת costimulatory B7-1 עם תג אחד המכיל עשר histidines (ICAM-1-12H, -12H B7-1) (איור 1) . K IE השני המולקולה ברמה טעונה פפטיד מכיל שתי שרשרת פוליפפטיד-מוטבע קרום (α β ו)ים. הטרנסממברני / תחומים cytoplasmic של שני הרשתות צריכים להיות מוחלפים עם תג המכיל שש histidines כל (k α β 6H -2x6H k 6H או IE IE). כחלופה, הארכת α-השרשרת עם עשר histidines ועוזב תחום תאי של β-השרשרת לא מתויג (והוליד k IE α β 0h 12H או -12H k IE) מוליד תוצאות משביעות רצון (איור 1).
תיוג ספציפי לאתר של pMHCs
חשוב לתייג pMHC stoichiometrically ואתר ספציפי כדי להיות מסוגל להמיר תשואות נמדדו סריג לקבועי שיווי משקל מחייב משמעותיים. זו יכולה להיות מושגת על ידי תיוג כימי של פפטיד סינטטי שהוא נטען לתוך שסוע מחייב פפטיד של מתויג היסטידין כיתת MHC רקומביננטי השני מולקולות 2,5. פפטיד כולל את כל השאריות של epitope תא T כמו Well כמקשר C-מסוף קצר (GGS) ואחריו ציסטאין (למשל בפפטיד ציטוכרום העש ג '(MCC) ANERADLIAYLKQATK- GGSC, מקשר מסומן באותיות מודגשות). ציסטאין זה משמש לתווית פפטיד stoichiometrically עם השימוש בנגזרי maleimide-צבע. בשלב זה טיפול נוסף צריך להיות מוקדש לאימות צבע צימוד כמותיים לפפטיד המכיל ציסטאין. HPLC-טיהור adduct פפטיד-הצבע מומלץ ולהיות מלווה ספקטרוסקופיה מסת יינון electrospray. כל המונים נרשמו מקבילים לeduct פפטיד (ללא צבע) משקפים תיוג שלם. אם זה נכון, פפטיד-מטוהר HPLC צריך להיות נתון לסיבובים רצופים של צבע תיוג עד התיוג נחשב כמותי. שים לב שיש להימנע ספקטרוסקופיה MALDI-TOF המוני כשיטת זו כרוכה קרינת לייזר ליינון מדגם. טיפול זה מתפרק fluorophores רגישה המצורפת לפני המוני פפטיד הוא לקרוא את וכך underrepre מעלות sents של צבע-נטיה.
תיוג עקיף עדיין אתר ספציפי של TCRs מאוגד תא עם השימוש שבברי F V שרשרת אחת חד ערכי
זה עדיין מאתגר לצרף צבעים לתא החלבונים של תאי חיים הקשורים משטח באופן ספציפי לאתר. כדי להתגבר על מכשול זה לTCRs משטח חשוף, גרסת שרשרת אחת חד ערכי (SCF V) מהגנים של הנוגדנים חד שבטיים -reactive TCRβ H57-197 2 נבנתה. המבנה הגבישי של נוגדן זה במורכב עם TCR מאפשר לעצב גרסה, שבו שאריות סרין בסמיכות לC-הסופית של פפטיד MHC הקשורים (בי צבע השותף המתאים סריג מצורף) מוחלפת לרציונאליות שאריות ציסטאין. ציסטאין מוטציה אז זה משמש כacceptor לנטיית צבע (איור 2).
מתודולוגיות להקליט סריג
NT "> ערכי סריג גורף הם מתאימים ביותר כדי לאמת את הקשר בין מרחקים בין-צבע שבחר וסריג יעילות נמדדת בTCR-pMHC זו מחייבת מערכת 2. בנוסף, מדידות סריג תפזורת לחשוף הבדלים איכותיים וכמותיים בזיקות TCR-pMHC הסינפטי ( ראה להלן וסעיף 3.2 פרוטוקול). גישות שונות לכימות יעילות סריג הוכנס בספרות 6. בסריג מאמר זה נרשם באמצעות(א) התאוששות תורם לאחר הלבנת acceptor, ובאמצעות
(ב) רגיש פליטת acceptor סריג.
השיטה הראשונה (א) דורשת שימוש בacceptor סריג שניתן photobleached בקלות, ותורם, שהוא לא photostable. בנוסף חשוב להבטיח שacceptor photobleached הוא כבר לא מסוגל מרווה הקרינה התורם. כאותו ערוץ זיהוי (תורם) משמש לכימות, אין תיקון גורמיםד אין סטיות כרומטי צריכים להיחשב, אשר הופכת פשוט מתודולוגיה זו ואמינה. עם זאת, לא ניתן לחזור מדידות כמותיות על אותה נקודת הדגימה ושינויים בסריג לא ניתן נרשמו לאורך זמן. כדי למנוע תופעות שנגרמו על ידי דיפוזיה מולקולרית או תנועתיות סלולריות צעד הלבנה מהיר צריך להיות מכוון ל, שמצמצם את הזמן שעובר בין התורם הראשון סריג (לפני הלבנת acceptor) והרכישה השנייה תורם סריג התמונה (לאחר הלבנת acceptor סריג). הוא ממליץ להעסיק מקור אור הלייזר רב עוצמה של סריג acceptor עירור הגל כדי למזער פעמים תאורה והלבנה.
לעומת זאת, בגישה של מדידת פליטת סריג רגיש (ב) תורם סריג הוא נרגש והפליטה של acceptor סריג נצפתה בערוץ acceptor סריג. שינויים באות acceptor סריג ניתן להקליט במשך זמן, אבל פליטה של תורם סריג לערוץ acceptor אדום העביר (termed bleedthrough) וסריג עירור צולב acceptor באמצעות עירור תורם צריכים להיקבע באופן מדויק ונוכו מערוץ acceptor סריג נרשם. לזה תמונות acceptor המקבילות תורם סריג וסריג צריכים להיות מיושרות מרחבית.
זיהוי של מולקולה בודדת (ס"מ) סריג אירועים
עם השימוש בלייזר כמקור עירור, מצלמה רגישה ומיקרוסקופיה TIRF-נחלש רעש הקרינה של fluorophores בודדת ניתן לייחס בקלות לאורך זמן. דומה נכון לאיתור אירועי smFRET מולקולאריים. עם זאת, סיבוכים עלולים להיגרם על ידי bleedthrough תורם סריג ועירור צולב של acceptor סריג, וטיפול ובכך גדול יש לקחת בעת כוונון צפיפויות fluorophore בניסוי smFRET.
בפרוטוקול המפורט להלן (סעיף פרוטוקול 4) TCR נבחר כתורם סריג בשפע גבוה וpMHC כacceptor סריג בשפע נמוך. כדי להחליש FR תורם ET bleedthrough מספיק, לקשט 10-30% מTCRs עם V SCF ניאון ו90-70% מTCRs עם V SCF לא פלורסנט. הנה ערוץ acceptor סריג נבחר כערוץ מולקולה בודד כי זה confocal עם המולקולה בודדת סריג ערוץ. זה עוזר ליישר אירועי smFRET עם מולקולה בודדת סריג acceptors, אשר מהווה את הבסיס של אימות smFRET.
חילוץ הסינפטי מחוץ לשיעורים דרך מדידות smFRET
Photobleaching של שני סריג תורם וסריג יש acceptor יטופל כאשר חילוץ מחצית החיים של אינטראקציות ממולקולה בודדת סריג עקבות. מספר סריג-אותות נצפים בתחילת ההופעה שלהם כזוג acceptor התורם יחיד N (0) מצטמצם לאורך זמן על ידי שני לא מחייב של photobleaching המורכב והקולט-ליגנד. מספר שרד מתחמים בזמן נתון N (t) יכול לבוא לידי ביטוי מתמטי כדלקמן:
<p class = "jove_content">בExp טווח photobleaching (-t / τ אקונומיקה) לא הזמן מתואר על ידי המוצר של מספר תצפיות n וזמן t התאורה החולה בגלל מצב התצפית שאינה רציף, הבדיד (כלומר, הלבנת מתרחש רק בתאורה ). בתוך exp- הטווח הקינטית (t / τ כבוי) הזמן t הוא התוצר של מספר תצפיות n והפיגור לא הזמן להתבוננות סריג יחיד (כלומר, לא מחייבים הקינטית קורה ברציפות). משוואת 1 יכול לבוא לידי ביטוי כ:
אקונומיקה / τ τ הטווח des החולהcribes מספר התצפיות עד הלבנה מתרחשת ומוגדרת כערך הציפייה <n להלבין> של הפונקציה מעריכית שלה. משוואה 2 ניתן לפשט באופן הבא:
ערך הציפייה <n (פיגור t)> של מספר מסגרות N (t) עם סריג-אירועים נצפים לאחר הזמן t נקבע ישירות מהניסוי. זה תלוי בזמן settable בין התצפיות (פיגור t) נבחרו בניסוי והערכים לא ידועים לτ את (ההופכי של מחוץ לשיעור k כבוי) ו< n להלבין>, ערך הציפייה של מספר התצפיות לפני ההלבנה מתרחשת .
לפיכך, חישוב ערך הציפייה <n (פיגור t)> לפחות שני ערכים של t <sub> פיגור מאפשר הקביעה הניסיונית של <n להלבין> וτ את.
חילוץ ערכי 2D-K D הסינפטי באמצעות מדידות מבוססות סריג
מדידת TCR התפוסה, כלומר, היחס בין TCRs הכפות וTCRs הכולל, הוא מרכזי לקביעת ערכי 2D-K D הסינפטי. על פי משוואה 4 מונח זה הוא ביחס ישר לנמדד סריג להניב עוד TCRs משמש כתורמי סריג וpMHCs כסריג acceptors.
עם התפוסה = TCR, C = גורם המרה
C הוא קבוע, אשר תלוי במערכת סריג וfluorophores בשימוש. זה יכול להיקבע באופן ניסיוני, כפי שמוצג להלן. ניתן להמיר את 2D-K D על פי משוואה 5 כאשרצפיפות ראשונית של ligands TCR לפני תוספת של תאי T לbilayer ידועה. סיבה לכך הוא הניידות הגבוהה של חלבונים מצורפים-SLB וגם בגלל SLBs לספק מאגר כמעט בלתי נדלה של ligands 2.
עם [ראשוני pMHC] = צפיפות ראשונית של pMHC לפני התוספת של תאי T
עם משוואות 4 ו -5 אחד יכולים עכשיו בקלות לקבוע את הסינפטי 2D-K D בין TCR וpMHC. הדבר נעשה באופן מהימן ביותר עם מדידות סריג המבוסס על התאוששות תורם לאחר הלבנת acceptor (ראה סעיף 3.1 פרוטוקול).
עם זאת, כדי למדוד את הקשר בין C עוצמת סריג אני סריג (תוקן לרקע, bleedthrough תורם סריג וסריג acceptor עירור צולב) ותפוסת TCR יש שייקבעו. לשם כך,צריך לדעת את R היחס בין עוצמת הקרינה הממוצעת של fluorophores אחת קשור-TCR סריג תורם (למשל Cy3 או AF555) SM אני סריג תורם והעוצמה הממוצעת של מולקולה בודדת סריג אירועי SM אני סריג. R תלוי במערכת סריג בשאלה, מסנני פליטה ומצלמה המשמשת לגילוי הקרינה.
TCR תפוסה אז ניתן לקבוע ישירות על פי משוואה 6.
עם R = SM אני סריג תורם / מ"ר אני סריג
R נקבע כ1.45 למערכת H57 scFv- Cy3 / pMHC-Cy5 מוביל ל:
= תפזורת אני סריג / אני TCR-Cy3 תפזורת • 1.45
מערכת היחסים בין תפוסת TCR ותשואת סריג יכולים להיקבע על ידי תורם סריג להתאוששy לאחר הלבנת acceptor. לשם כך שני הפרמטרים הם זממו נגד אחד אחר למספר microclusters TCR כפי שמוצגים באיור 4 א מדרון .the של הכושר ליניארי מציין C מקדם המרה (ממשוואה 4).
כפי שמודגם באיור 4 א, ג מסתכם ל() V H57 SCF – Cy3 מערכת סריג pMHC-Cy5 / ו (ב) לתצורת מערכת מיקרוסקופ להחיל 1.995. TCR תפוסה ניתן להסיק בקלות כדלקמן:
תפוסת TCR = סריג להניב • 1.995
מדידת אינטראקציות בין חלבונים באתרו היא רצויה מאוד במיוחד כאשר התמודדות עם אינטראקציות זיקה נמוכות כגון TCR-pMHC מחייב 11. סיבה לכך הוא על-השיעור, כמו גם את היציבות של אינטראקציות אלה השפיעו באופן משמעותי על ידי נסיבות מסוימות שבהם מחייבים מתרחשים. גישות הדמיה מבוססת סריג מינימאלי פולשנית ולכן הם באופן עקרוני בצורה מושלמת המתאימים למשימות כגון, עדיין כרוכות במספר המכשולים שצריכים להתגבר ראשון. רעש שנוצר על ידי autofluorescence הסלולרי מגביל את הרגישות של המדידות ולכן צריך להיות כל הזמן במינימום. מיקרוסקופיה TIRF משרתת את הצורך הזה גם 12 מאוד אבל דורשת functionalization זכוכית שקופיות, באופן אידיאלי בצורה של bilayer שומנים מישוריים נתמך זכוכית מעוטרת עם חלבונים של הבחירה 13-15. יתרון נוסף של גישת reconstitutive חלקית הוא ששותפי סריג bilayer תושב רקומביננטי יכולים להיות הרבה מ 'עפרות שכותרתו בקלות באופן כמותי, באתר ספציפי והגיוני עם fluorophores קטנה יותר ובהירה יותר יהיה אפשרי עם חלבונים הביעו פני תא. TCRs מתויג עם SCF רקומביננטי V של, שאינו משפיע על הכרת תא T, כפי שנבדק בעבר 2. יתר על כן, הרכב החלבון של SLB, למשל הצפיפות של pMHCs והבחירה של גורמי אבזר יכולים להיות מותאם לצרכים של אחד ספציפיים. אנחנו ביצענו בעבר ניסויים עם משתנה צפיפות של pMHCs גירוי, אך לא זוהו הבדלים משמעותיים ב2D-K את ו2D-K D 2.
עד כה כאן ההכרה של מולקולות MHC II כיתה כבר עסקה רק, בעיקר בגלל האופי של שסע פפטיד מחייב, אשר פתוח בשני הקצוות וכך להכיל פפטידים גדולים כוללים מקשר לקובץ מצורף fluorophore. במקרים מסוימים גישה כזו עלולה גם לעבוד עבור CLA MHC תיוגss אני מולקולות 16 אבל יש לנקוט זהירות רבה כדי לוודא את השימוש בם בניסויים. הרגישות של תאי T כלפי אנטיגנים, שניתן למדוד באמצעות מבחני התפשטות תאי T, כמו גם pMHC-TCR מחייב קינטיקה כפי שנמדדו במבחנה על ידי תהודת plasmon פני השטח לא צריך להיות מושפעת על ידי התוספת של מקשר וfluorophore ל פפטיד. לחלופין, מעמד MHC אני מולקולות עצמן יכול להיות מתויג באופן ספציפי לאתר עם ההקדמה של ציסטאין מזווג בתוך הרצף של השרשרת הכבדה (תצפיות לא פורסמו).
עם השימוש בבדיקות מולקולריות מתאימות כל אינטראקציה בין חלבונים סינפטיים יכולה בעיקרון להיות למדה באופן מתואר במסמך זה. בדיקות כאלה, למשל, של SCF V או חלבונים עוצב Ankyrin חזרו (DARPins) 17, צריכה להיות חד ערכי וצריך לקשור היעד שלהם ביציבות מבלי להשפיע על האינטראקציה של עניין. כמובן, informatio המבניn רצוי מאוד לעיצוב בדיקה רציונלים אבל לא חובה מוחלטת. בעת הקמת זוג שותפי סריג חדש, מומלץ להקליט ולנתח סריג בכמויות הגדולה הראשונה. אתרים של קובץ מצורף תווית עשויים להיות מגוונים במידה ניכרת על מנת למקסם את אות סריג וגם כדי לוודא שתשואות שנמדדו סריג להשתנות בהתאם למרחק בין הצבע. ברגע שהמערכת מותאמת, מולקולה בודדת סריג אותות עשויים להיות מוקלטים על ידי הגבלת התיוג של שותף סריג שפע הגבוה ל10-30% והלבנת שותף סריג שפע הנמוך עד מולקולות בודדות הן פתירות בתחום התאורה.
אחרון חביב יש לציין כי SLBs משוער כמה אבל לא את כל ההיבטים של קרום פלזמה פיסיולוגי. תכונות כגון עקמומיות קרום וגמישות, מידור תחום, שחלופי cytoskeletal ותנועתיות תא, כמו גם מגוון גבוה של חלבונים בממברנה-הביע משטח אינן מיוצגות על ידי SLBs אבל עשוי להשפיע לאהוא לעבד תחת חקירה. הרבה מאמץ צריך להיות מושקע להקים שיטות הדמיה המאפשרות ניטור אינטראקציות חלבון-חלבון עם רזולוציה מולקולה בודדת בסינפסות הפיזיולוגית, שאינן נגישים להדמית TIRF.
The authors have nothing to disclose.
תואר שני נתמכה על ידי מענק של שרדינגר קרן המדע האוסטרי (FWF, J3086-B11) ותודה מקס פלנק-החברה לתמיכה כספית ומנהלית. GS וJH נתמכו על ידי קרן המדע והטכנולוגיה וינה (WWTF, LS13-030).
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Sf900 II | Life Technologies | 10227402 | insect cell media for baculo virus production |
Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza) | Fisher Scientific | 10564038 | insect cell media for baculo virus expression |
Sf9 cells | Life Technologies | 11496-015 | cells for virus production and expansion |
High Five Cells | Life Technologies | B855-02 | cells for potein expression |
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Centramate System | Pall | protein concentartion from large volumes | |
Centramate cassette 10kDa cutoff | Pall | OS010T12 | protein concentartion from large volumes |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC900308 | protein concentartion |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC800308 | protein concentartion |
Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL | EMD Millipore | 5123 | protein concentartion |
Äkta pure 25L | GE Healthcare | 29-0182-24 | protein purification |
Superdex 200 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5175-01 | protein purification |
Superdex 75 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5174-01 | protein purification |
Mono Q 5/50GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | protein purification |
Ni Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-01 | protein purification |
Tricorn 10/20 column | GE Healthcare | 28-4064-13 | protein purification |
Gilson HPLC system | Gilson | purificationof fluorochrome-coupled peptides | |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size | Agilent | A6000250X212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size | Agilent | A6000050G212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Tricorn 10/20 column | GE Healthcare | 28-4064-13 | protein purification |
Gilson HPLC system | Gilson | purificationof fluorochrome-coupled peptides | |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size | Agilent | A6000250X212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size | Agilent | A6000050G212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Cy3 maleimide | GE Healthcare | PA23031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Cy5 maleimide | GE Healthcare | PA25031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20347 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Fura-2, AM, cell permeant | Life Technologies | F-1221 | calcium-sensitive dye for cell labeling |
dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 151874 | for dissolving fura-2 am |
Hank's Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium | Fisher Scientific | 10225362 | imaging buffer |
PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
Bovine Serum Albumin lyophilized powder | Sigma Aldrich | A2153 | supplement for imaging buffer |
14-4-4S antibody | affimetrix eBioscience | 14-5980-81 | blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR) |
5 ml polypropylene round-bottom tube | Becton Dickinson | FALCON 352063 | |
0.22 μm Ultrafree-MC centrifugal filter unit | EMD Millipore | UFC30GV0S | |
Syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Life technologies | T-7279 | |
Microscope for fura-2-based calcium measurements | LEICA | DMI4000B | |
Microscope for (single molecule) FRET measurements | LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | |
planar supported lipid bilayers | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | ||
RPMI 1640, with L-Glutamine | Life Technologies | 11554416 | T-cell media |
non-essential amino acid 100X | Hyclone | SH30238.01 | T-cell media supplement |
penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x | Life Technologies | 12000226 | T-cell media supplement |
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | T-cell media supplement |
mouse interleukin-2 recombinant protein | BPS Bioscience | 90185-B | T-cell media supplement |
Research Grade Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | T-cell media supplement |
Origin (analysis program) | OrigenLab | http://www.originlab.com/ | non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag]) |