Vorbereitung der Mitochondrial angereicherten Fraktionen für die Stoffwechselanalyse in<em> Drosophila</em
Özet
Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.
Abstract
Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.
Introduction
Das Ziel dieses Verfahrens ist es, angereicherten mitochondriale Fraktionen, die genug mitochondrialen Metaboliten für Metabolomics-Studien mit Drosophila melanogaster Ausbeute zu entwickeln. Nach unserer Erfahrung Metabolomics-Analyse unter Verwendung von Vollzellextraktionsverfahren sind nicht imstande, subtile mitochondrialen Stoffwechselveränderungen videodan Drosophila zu erkennen. , Mitochondriale Fraktionierung vor der Metabolomics-Analyse erhöht jedoch die Empfindlichkeit auf der mitochondrialen Metaboliten Verschiebungen zu identifizieren.
Mitochondrien sind Organellen zur Bereitstellung 90% der Energie, die Zellen brauchen für die normale Funktion 1 verantwortlich. In den letzten Jahren hat man erkannt, dass Mitochondrien spielen in zellulären und organismischen Funktion eine viel dynamischere Rolle als nur die Herstellung Adenosintriphosphat (ATP) und sind nun als Knotenpunkte für die Regulierung der metabolischen Homöostase 2,3 angesetzt. Mitochondrien sind das Ergebnis eine endosymbiontische Verfahren, bei dem distinct mikrobiellen Linien verschmolzen ~ Vor 1500000000 Jahre 4. Als Mitochondrien in wahre Organellen entwickelt wurden Gene aus der Endosymbionten in der entstehenden Kerngenom integriert. Bei Tieren heute sind ca. 1500 mitochondriale Proteine kerncodierten während 37 Gene in der mtDNA, von denen 13 kodieren mitochondriale Proteine, die Untereinheiten der Enzymkomplexe der oxidativen Phosphorylierung 5 bleibt. Die Koordinierung zwischen den Mitochondrien und Kernfächer benötigt wird, um die ordnungsgemäße Funktion der Mitochondrien zu halten.
Mit den hier beschriebenen Methoden konnten wir mitochondriale Stoffwechselveränderungen videodan Drosophila, die von Manipulation der Abstimmung zwischen mitochondrialer und nuklearer Genome führen zu erkennen. Wir verwendeten einen Stamm von Drosophila, in der mtDNA von ihrer Schwesterarten D. simulans wurde an einem einzigen D. platziert melanogaster Kern Hintergrund 6. Diese 'gestört' mitonuclearGenotyp wurde auf die "native", oder co-entwickelt mitonuclear Genotyp D. Vergleich melanogaster, die dasselbe Kerngenom mit seiner nativen D. melanogaster mtDNA. Die D. melanogaster und D. simulans mtDNAs unterscheiden sich um ~ 100 Aminosäuren und> 500 auch Substitutionen, die mitonuclear Kommunikations 7,8 beeinflussen. Wir erzeugten gesamten Fliegenextrakten und mitochondriale angereicherte Extrakte Metabolit Verschiebungen als Reaktion auf pharmakologische Stress zu studieren. Hier zeigen wir, dass bei der Verwendung der mitochondrialen angereicherten Fraktionen wir erkennen ausgeprägte Veränderungen in der mitochondrialen Metaboliten zwischen dem nativen, co-entwickelt Genotyp tragenden D. melanogaster mtDNAs und die aufgebrochenen Genotyp tragen D. simulans mtDNA. Im Gegensatz dazu sind die Stoffwechselveränderungen zwischen diesen beiden Genotypen subtile Verwendung normaler Verfahren, die gesamte fly Extrakt zu verwenden. Daher, sofern diese Methode einen Weg, um zu verstehen, wie mtDNAs vermitteln mitochondrialen VeränderungenReaktion auf verschiedene Medikamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind: 1) die Aufzucht genug Fliegen in reichlich Platz. Es ist sehr wichtig, um die Demographie Käfigen mit mehr als 150 Fliegen je nicht übervölkern; 2) Veränderung der Lebensmittel der Käfige häufig Nahrungskonkurrenz und Ernährungs Stress zu vermeiden; und 3) die Beibehaltung aller Proben bei 4 ° C, um die Integrität während der Isolierung der mitochondrialen Fraktion zu gewährleisten. Es wird auch empfohlen, den Isolationspuffer, der Waschpuffer und das Glas-Do…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Adelphi University faculty development grant and grant R15GM113156 from NIGMS awarded to EVC, grant R01GM067862 from NIGMS and grant R01AG027849 from NIA awarded to DMR.
Materials
| 0.2% tegosept -methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 liter cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 liter cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
Referanslar
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