Plasmide afkomstig DNA Strand Displacement Gates Uitvoeringsbesluit Chemical Reaction Networks

1. Sequence ontwerp Opmerking: Sequence ontwerp overzicht: In deze paragraaf wordt de strategie voor het ontwerpen van plasmide afkomstig DNA poorten beschreven. Enzymplaatsen geplaatst aan beide zijden van de poorten om de vrijlating volledig dubbelstrengig poorten na digestie. Nicking sites worden vervolgens zodanig geplaatst dat enzymen creëren nicks op de bovenste streng naar de finale ndsDNA poorten te creëren. Tenslotte worden de resterende sequenties zodanig gekozen dat onafhankelijke domeinen orthogonaal aan elkaar en vertonen geen secondaire structuur. Plaats de Nt.BstNBI nicking plaats vier nucleotiden van het 3 'uiteinde van elke lange domein (a, b, c, r, en i). Plaats de Nb.BsrDI nicking plaats op elk uiteinde van de lange domein 5 (a, b, c, en r. Merk op dat het domein i niet elk Nb.BsrDI inkeping site). Figuur 2C toont de gedetailleerde weergave van sequentie Join AB en Vork BC poorten. Plaats de PvuII-restrictieplaats aan beide uiteinden van ndsDNA poorten zodat PvuII digestie kan loslaten gates van plasmiden (zie figuur 2C). Ontwerp ongedwongen andere sequenties door twee volgende principes: (a) onderdelen mag vertonen secundaire structuren (DNA structuren kunnen worden voorspeld met behulp Nupack 41), en (b) alle domeinen moeten loodrecht overspraak te minimaliseren. Plaats ndsDNA sequenties in het midden van een poort template. Plaats 30-40 bp willekeurige spacersequenties aan beide uiteinden van de matrijs poort elke afstandhouder als uniek bindingsplaats voor de volgende Polymerase Chain Reaction (PCR). 2. Klonen van NdsDNA Gates in plasmiden Opmerking: Dit deel beschrijft de Gibson klonen methode voor het invoegen van 4 exemplaren van de poort in een plasmide backbone. Om ndsDNA poort templates als dubbelstrengs genomische blokken van een DNA-fabrikant (gate template sequenties worden getoondin tabel 1; strengen komen in ndsDNA poorten zijn getoond in tabel 2; level domein sequenties worden getoond in Tabel 3). Na ontvangst van de bestelde DNA, draaien de buizen die genoom blocks 10,000-14,000 xg gedurende 1 minuut om te verzekeren dat alle gedroogde DNA op de bodem van de buis. Resuspendeer de gedroogde genomische regel in DNase-vrij water tot een uiteindelijke concentratie van 10 ng / pl te bereiken. Opmerking: Als alternatief kan DNA worden geresuspendeerd door middel 1x Tris ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) buffer (TE-buffer: 10 mM Tris en 1 mM EDTA, pH 8,0). Echter, EDTA is een chelerend middel voor divalente kationen en PCR kan remmen. Genereren 4 poort fragmenten met verschillende overlap regio's door middel van een standaard PCR met een High-Fidelity DNA polymerase (zie figuur 3A). De primersequenties zijn vermeld in Tabel 4 (smelttemperatuur van deze primers is 62 ° C). Voer een 2% agarosegel in 140 V gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (voor een gedetailleerde agarosegelelektroforese protocol zie 42) en snijd de band van elke PCR geamplificeerde fragment uit de gel. Zuiveren dan de gel plakken met behulp van een gelextractiekit (zie de Materials) volgens de instructies van de fabrikant. Digest een hoog kopie-aantal plasmide backbone (zie materialen) met PvuII en PstI-HF-HF bij 37 ° C gedurende 1 uur (zie tabel 5) volgens het protocol van de fabrikant. PvuII-HF en Pstl-HF zijn high-fidelity restrictie enzymen, die drastisch verminderen niet-specifieke bezuinigingen. Voer een 1,5% agarosegel en snijd de gelineariseerde backbone (meestal draaien de gel bij 140 V gedurende 30-40 min bij RT). Extract dan het DNA uit de gel slice behulp gelextractiekit de instructies van de fabrikant. Voer Gibson samenstel 43 met de gelineariseerde vector en gezuiverde PCR-fragmenten (zie tabel 6 en figuur 3B </strong>) bij 50 ° C gedurende 1 uur. Transformeer de Gibson samenstel product van stap 2.8 in Escherichia coli (E. coli) en plaat op een lysogenie Broth (LB) agar platen bevattende ampicilline antibiotica (bij een concentratie van 100 ug / ml). Voeren transformatie door middel van elektroporatie of heat shock methode 44,45, en gebruik de juiste E. coli stam. Gebruik bijvoorbeeld E. coli-stam JM109 voor heat shock transformatie, en gebruik DH5a elektrocompetente E. coli-cellen voor elektroporatie. Opmerking: De plasmideskelet gebruikt bevat een ampicilline resistentie cassette. Bij gebruik van een andere selectie marker, gebruik de juiste antibiotica in plaats van ampicilline. 3. Bacteriële Cultuur Amplification en Quality Control Opmerking: Dit deel beschrijft de massaproductie en isolatie van plasmiden die de DNA-poorten na kwaliteitscontrole. Kies een enkele kolonievan Ampicillin selectieve plaat uit stap 2,9 en incuberen van een kweek van 3 ml verrijkt medium dat ampicilline antibiotica (bij een concentratie van 100 ug / ml). Markeer de kolonie zodat het opnieuw kan worden gebruikt in daaropvolgende experimentele stappen. Groeien de cultuur bij 37 ° CO / N met krachtig schudden (200-300 rpm). Typisch, incubeer 16-24 uur. Extraheer het plasmide DNA uit de bacteriecultuur behulp van een mini-prep kit volgens de instructies van de fabrikant. Meet het gezuiverde plasmide-DNA onder toepassing van een spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant. Typische opbrengst varieert van 50-1000 ng / ul. Verkrijg de geëxtraheerde plasmide-DNA gesequentieerd door verzending van het monster met een DNA sequencing bedrijf. Sequencing primers moet zich ongeveer 100 nucleotiden stroomopwaarts en stroomafwaarts van het gebied waarvan de sequentie; de sequencing primer voor het plasmide (zie materialen plasmide) heeft de volgende sequentie: ATTACCGCCTTTGAGTGAGC. Neete: Als er reeks fouten of recombinatie in de geplaatste ndsDNA poorten, selecteer een andere kolonie van de plaat uit stap 2.9. Volg de stappen 3,1-3,4 om te controleren of de sequenties van de geplaatste poorten correct zijn. Na verificatie van de sequenties correct zijn, kies de corresponderende kolonie van Ampicilline selectieve plaat (uit stap 2.9) en incubeer een cultuur van 800 ml Terrific Broth (TB) dat ampicilline antibiotica (bij een concentratie van 100 ug / ml). Groeien de kweek bij 37 ° C gedurende 16-24 uur onder krachtig schudden (200-300 rpm). TB bijzonder is zeer geschikt voor high yield plasmide productie. Opmerking: Als alternatief LB kan ook worden gebruikt om bacteriën te kweken, hoewel de opbrengst plasmide een probleem kan zijn. Zuiver het DNA met een Maxi-prep kit volgens de instructies van de fabrikant. Volg stap 3,3-3,4 om te controleren of de sequenties correct zijn. Als een recombinatie plaatsgevonden, zie de volgende noot. Anders is, ga naar stap 4. <br /> Opmerking: Een mogelijk probleem hier is dat meerdere exemplaren van de ingebrachte poorten in de plasmide kunnen recombineren als gevolg van DNA-herstel. Om dit probleem aan te pakken, maken gebruik van een E. coli stam zonder het recA-eiwit (een eiwit gerelateerd aan DNA herstel) zoals JM109 of DH5a een eerder sequentie geverifieerd plasmide transformatie (dwz zonder sequentiefouten en recombinatie). Kies dan een kolonie van deze plaat en controleer het plasmide sequentie door het sturen van het monster aan een DNA-sequencing bedrijf. 4. Enzymatische Processing Opmerking: Dit hoofdstuk beschrijft het proces van het verteren van de plasmiden zodanig dat zij worden gesneden en gejat in de juiste locaties en klaar om te worden gebruikt voor de kinetiek experimenten. Digest het gezuiverde plasmide-DNA uit stap 3.7 met restrictie-enzym PvuII-HF gedurende 1 uur bij 37 ° C (zie tabel 7). Typisch verteren het plasmide met 4 eenheden PvuII-HF per 1 mg plasmide. Hoge FIDelity restrictie-enzymen worden aanbevolen voor gebruik, omdat ze drastisch verminderen van niet-specifieke bezuinigingen. Voer ethanolprecipitatie op het monster. Voeg 2 gelijke volumes ijskoude absolute ethanol aan het monster. Incubeer het mengsel bij -80 ° C gedurende ten minste 1 uur (dit mengsel kan ook plaatsnemen bij -80 ° C O / N). Centrifugeer bij 10,000-14,000 xg bij 0 ° C gedurende 30 min. Verwijder het supernatant. Naar 1000 pl RT 95% ethanol aan het monster en zwenken 10-15 maal. Centrifugeer bij 10,000-14,000 xg bij 4 ° C gedurende 10 min. Verwijder het supernatant en de lucht drogen op de bank voor 10-20 min. Resuspendeer de DNA pellets in een geschikt volume van Nuclease vrije H 2 O (gewoonlijk 100-200 pl). Het toevoegen van meer dan 200 gl algemeen maakt het monster te verdund voor gebruik in kinetiek experimenten. Meet de geresuspendeerde DNA onder toepassing van een spectrofotometer volgens de minstructies producent behoudt's. Digest mee poorten met knikken Nb.BsrDI enzym bij 65 ° C gedurende 1 uur onder toepassing van 4 eenheden enzym per 1 ug plasmide (zie tabel 8); digest vork poorten met knikken Nt.BstNBI enzym bij 55 ° C gedurende 1 uur met behulp 8 eenheden enzym per 1 ug plasmide (zie Tabel 9). Opmerking: Stap 4,2 verwijdert enzymdigestie buffer en helpt concentraat poorten voor kinetiek experimenten. Stap 4.2 kan worden overgeslagen voor de poorten te sluiten, omdat beide restrictie-enzym PvuII-HF en jatten enzym Nb.BsrDI dezelfde spijsvertering buffer delen. In stap 4.2.8, wordt Nuclease vrij H2O gebruikt in plaats van TE omdat EDTA is een chelerend middel voor tweewaardige kationen en kan restrictie-enzymen die deze ionen moeten functioneren remmen. Opmerking: De toevoeging van overmaat enzymen kunnen leiden tot grote hoeveelheden initiële circuit lekken (Figuur 4), die waarschijnlijk wordt veroorzaakt door over-digestie 46. Deze kwestie can door het optimaliseren van het enzym worden gericht bedragen (zie figuur 4). Typische bereik van enzymen is 1-10 eenheden / 1 ug plasmide. 5. Voorbereiding van de Single-oligonucleotiden Opmerking: Dit deel beschrijft het protocol voor resuspenderen en kwantificeren van de chemisch gesynthetiseerde enkelstrengs DNA (ssDNA), die zal worden gebruikt voor het signaal strengen en extra strengen. Voor streng sequenties zie Tabel 10. Merk op dat het volgende protocol is een voorbeeld van bereiding 10 uM ssDNA. Andere concentraties ssDNA kan op soortgelijke wijze worden bereid. Na ontvangst van oligo DNA fabrikant, draaien de buizen met DNA bij 10,000-14,000 xg gedurende 1 minuut om te verzekeren dat alle gedroogde DNA op de bodem van de buis. Resuspendeer de DNA behulp 1x Tris ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) buffer (TE-buffer: 10 mM Tris en 1 mM EDTA, pH 8,0) tot een uiteindelijke concentratie van 100 uM. VoorBijvoorbeeld, resuspendeer 8 nmol DNA in 80 ui TE-buffer. Meng 10 gl van het DNA bij 100 uM met 90 gl moleculaire water in een microcentrifugebuis, waarbij een eindconcentratie van 10 uM moet worden gehaald. Meet de precieze concentratie van het DNA monster met behulp van een spectrofotometer de instructies van de fabrikant. Het volgende protocol toont een voorbeeld van hoe DNA-concentratie kan worden gemeten. Blanco de spectrofotometer met 2 pl moleculaire water. Meet de absorptie bij 260 nm (A260) van het DNA-monster. Gebruik de volgende vergelijking om de voorraad concentratie te berekenen. Opmerking: Het monster concentratie is M = A 260 / extinctiecoëfficiënt. De extinctiecoëfficiënt is te vinden op de specificatie datasheet door het DNA fabrikant. 6. Voorbereiding van de TL-Reporters Opmerking: Dit deel beschrijft deprotocol voor het bereiden van Reporter C, kunnen andere fluorescerende reporters op dezelfde manier worden gemonteerd. Bestellen high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) gezuiverd oligonucleotiden ROX- <c * tc> (de bovenste streng van Reporter C) en <c> -RQ (de onderste streng van Reporter C) uit DNA fabrikant (zie Tabel 10 voor sequenties ). Na ontvangst van de gesynthetiseerde oligonucleotiden, resuspendeer en kwantificeren monsters zoals beschreven in stap 5. Meng de verslaggever boven- en onderkant strengen (dwz ROX- <c * tc> tr <c> -RQ) in 1x Tris-acetaat-EDTA (TAE) met 12,5 mM Mg 2+ (zie Tabel 11 voor de gedetailleerde recept ). Merk op dat hier 30% overmaat deactiveringsmiddel gemerkte streng <c> -RQ wordt toegevoegd aan de reporter, die ervoor zorgt dat alle fluorofoor gemerkte strengen worden gedoofd, zelfs met imperfecte stoichiometrie monteren. Gloeien de Reporter C complex met een thermische cycler, koelen van 95 ° C tot 20 ° C met een snelheid van 1 ° C / min. De monsters kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C. 7. Fluorescentie metingen Opmerking: Het gedeelte wordt een algemeen protocol voor fluorescentie kinetiek metingen (zie figuur 5 voor de experimentele procedure), en dit protocol worden gebruikt in de stappen 8, 9 en 10. Merk ook op dat het protocol voor het gebruik van een spectrofluorimeter. Als alternatief, deze experimenten kan ook worden in een plaat reader uitgevoerd hoewel gevoeligheid, well-to-well variaties en het gebrek aan controle van de temperatuur op de lange termijn experimenten een probleem kan zijn. Stel de temperatuurregelaar tot 25 ° C, en wacht tot de temperatuur te stabiliseren. Met behulp van een temperatuurregelaar kan verminderen variabiliteit in het signaal die kunnen voortvloeien uit temperatuurvariatie. Stel de juiste parameters for kinetica metingen in het data acquisitie software van de spectrofluorimeter. Gedetailleerd voorbeeld zijn als volgt: Stel de spleetbreedte tot 2,73 nm voor zowel excitatie en emissie monochromatoren. Stel de integratie tijd tot 10 seconden voor elke 60 seconden time-point. Stel de totale meettijd tot 24 uur. Stel de excitatie / emissie golflengten de fluoroforen gebruikt in het experiment passen. Voorbeeld golflengten zijn: ROX (588 nm / 608 nm) en TAMRA (559 nm / 583 nm). Voeg Nuclease vrij H2O en 10x Tris-acetaat-EDTA-buffer bevattende 125 mM Mg2 + (10 x TAE / Mg2 +) om een synthetische kwarts cel. Zie de tabellen 12, 13 en 14 bijvoorbeeld volumes te gebruiken. Voeg polyT strengen tot een uiteindelijke concentratie van ~ 1 uM (zie tabel 12, 13 en 14 voor volumes) bereikt, en vervolgens de vortex synthetischekwarts cellen gedurende 10-15 sec. In het algemeen zal pipetpunten aspecifiek DNA binden. Het toevoegen van hoge concentraties polyT strengen kan deze niet-specifieke binding fouten te verminderen. Verslaggevers en hulpstoffen strengen voegen. Zie Tabel 12, 13 en 14 bijvoorbeeld volumes te gebruiken. Merk op dat voor reporter kalibratie geen extra draden nodig. Voeg 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) tot een eindconcentratie van 0,15% SDS realiseren. Opmerking: SDS wordt gebruikt om enzymen uit het plasmide afgeleide poorten dissociëren omdat enzymen kunnen interfereren met de strengverplaatsing reactie (zie figuur 6). SDS Hier wordt aanbevolen in plaats van de warmte denaturatie van enzymen om de dissociatie en onjuiste recombinatie van poort strengen, hetgeen nadelig kan zijn het circuit functie te voorkomen. [Sla deze stap voor reporter kalibratie.] Voeg mee en vork poorten (zie tabel 13 en 14 voor volumes)de synthetische kwarts cel en meng de oplossing door pipetteren op en neer ten minste 20 keer (niet vortex de cuvette omdat vortexen oplossingen SDS kan leiden tot bellen die invloed fluorescentie kinetiek metingen). Ook naar de volgende meetstappen zo spoedig mogelijk door het lek reactie initieert onmiddellijk na de toevoeging van sluiten en vork poorten van het synthetische kwarts cel. Plaats de synthetische kwarts cellen in de kamer van een spectrofluorimeter. Start de kinetiek meting. Na 5 min metingen, voeg ingang strengen (zie tabel 12, 13 en 14 voor volumes) om de synthetische kwarts cel en meng de reactie door pipetteren op en neer ten minste 20 maal. Merk op dat het monster voorzichtig moeten worden gemengd om luchtbellen te vermijden. Voer deze stap, terwijl de data-acquisitie programma wordt onderbroken om te voorkomen dat het meten van signalen getriggerd door externelicht. Noteer de reactiekinetiek totdat steady state bereikt. De reactie kinetiek worden weergegeven op de computer. 8. Calibrate Fluorescent Reporters Opmerking: Dit deel beschrijft het protocol voor het maken van kalibratiecurves van fluorescerende verslaggevers. Kalibratiecurven worden gebruikt om willekeurige fluorescentie-eenheden om te zetten signaal molaire concentratie. Kalibreren fluorescerende verslaggevers na de in Stap 7. Gebruik de volumes van de reagentia en buffers beschreven protocol zoals samengevat in Tabel 12 De standaard concentratie voor dit voorbeeld is 50 Nm (1x).; verslaggevers zijn dan 3x; input 1x. Voor gevallen waarin de inbreng <tc c> zijn dan 0,25x, 0,5x, 0,75x, past het volume van de Nuclease gratis H 2 O navenant aan de uiteindelijke volume van elke reactie te houden tot 600 pi. Een voorbeeld data worden getoond in figuur 7A. Maak een ijkkromme van deReporter C met een lineaire regressie van de uiteindelijke fluorescentiewaarden tegen de beginconcentratie van signaal C (een voorbeeld kalibratiekromme is weergegeven in figuur 7B). Deze kalibratiecurve kan worden gebruikt om willekeurige fluorescentie-eenheden om te zetten naar zijn overeenkomstig signaal concentratie. 9. kwantificeren van de concentratie van plasmide-afgeleide ndsDNA Gates Let op: elk onafhankelijk verwerkte partij van plasmide afgeleid ndsDNA poorten resultaten in een andere opbrengst van functionele poorten, en dit deel beschrijft een protocol voor het kwantificeren van de concentratie van plasmide afgeleid ndsDNA poorten. Kwantificeren van de concentratie van plasmide afgeleid ndsDNA poorten naar aanleiding van de in Stap 7. Gebruik de volumes van de reagentia beschreven als samengevat in tabel 13 protocol Opmerking:. Tabel 13 beschrijft een voorbeeld recept voor Fork BC kwantificering Deelnemen. </em> AB en andere poorten kunnen op soortgelijke wijze worden uitgevoerd, maar via verschillende input strengen ondersteunende strengen en reporters. Zet de uiteindelijke fluorescentie gemeten in dit experiment tot een concentratie van signaal C behulp van de ijkgrafiek van stap 8,2. Dan terug berekenen van de ndsDNA poort concentratie. Bijvoorbeeld, een uiteindelijke fluorescentie waarde voor de gate kwantificering experiment correspondeert met 25 nM signaal C (0.5x) op basis van de kalibratiecurve figuur 7B. Omdat de voorraad van Fork BC 40 maal in deze reactie verdund voorraad concentratie van de vork BC poort 1 uM. 10. Kinetics Metingen voor de reactie A + B-> B + C Opmerking: Dit hoofdstuk beschrijft een protocol voor het testen van de DNA realisatie van een formele chemische reactie met behulp van fluorescentie kinetiek metingen. Pervorm kinetische metingen door de in stap 7. Gebruik volumina van reagentia en buffers beschreven protocol zoals samengevat in Tabel 14.