Presentamos protocolos que permiten a los refinados en el seguimiento in vivo de la función de la unidad de motor en el ratón. Técnicas para medir el potencial de acción muscular compuesto (CMAP) y el número de la estimación de la unidad de motor (MUNE) en los músculos de las extremidades traseras ratón inervados por el nervio ciático se describen.
Compound muscle action potential (CMAP) and motor unit number estimation (MUNE) are electrophysiological techniques that can be used to monitor the functional status of a motor unit pool in vivo. These measures can provide insight into the normal development and degeneration of the neuromuscular system. These measures have clear translational potential because they are routinely applied in diagnostic and clinical human studies. We present electrophysiological techniques similar to those employed in humans to allow recordings of mouse sciatic nerve function. The CMAP response represents the electrophysiological output from a muscle or group of muscles following supramaximal stimulation of a peripheral nerve. MUNE is an electrophysiological technique that is based on modifications of the CMAP response. MUNE is a calculated value that represents the estimated number of motor neurons or axons (motor control input) supplying the muscle or group of muscles being tested. We present methods for recording CMAP responses from the proximal leg muscles using surface recording electrodes following the stimulation of the sciatic nerve in mice. An incremental MUNE technique is described using submaximal stimuli to determine the average single motor unit potential (SMUP) size. MUNE is calculated by dividing the CMAP amplitude (peak-to-peak) by the SMUP amplitude (peak-to-peak). These electrophysiological techniques allow repeated measures in both neonatal and adult mice in such a manner that facilitates rapid analysis and data collection while reducing the number of animals required for experimental testing. Furthermore, these measures are similar to those recorded in human studies allowing more direct comparisons.
Motor número de unidad de estimación (MUNE) fue descrito originalmente por McComas et al. 1 más de tres décadas. La técnica original era una modificación de la técnica de grabación de potencial de acción muscular compuesto (CMAP) que emplea un aumento gradual de la estimulación para obtener incrementos submáximos. Estos incrementos se suman y promedian para determinar un tamaño estimado de un potencial de una sola unidad de motor (SMUP). Este tamaño se dividió en la respuesta CMAP para estimar el número de unidades motoras que inervan el músculo se está probando. Después de la descripción original, numerosas variaciones utilizando tanto las respuestas electrofisiológicas y de la fuerza incremental de las mediciones (mecánicas) se han utilizado en ambos estudios en humanos y modelos animales 2. La técnica de MUNE fue modificada por Shefner y sus colegas para investigar modelos de ratón de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) 3, 4.
En la descripción actual, detallamos simplifmodificaciones del IED de las técnicas de MUNE que son rápidas de realizar. Es importante destacar que, CMAP y MUNE permiten medidas fiables tanto en ratones recién nacidos y adultos 5-8. Individuos experimentados pueden realizar estas medidas en 10-20 minutos por animal y medidas repetidas son factibles que permite la adquisición de datos longitudinales 5. En los estudios actuales, empleamos un sistema de electrodiagnóstico clínica. En nuestra experiencia, los sistemas de electrodiagnóstico clínicos están optimizados para la captura rápida y eficiente de los datos electrofisiológicos in vivo, plataformas electrofisiológicas estándar, sin embargo, se pueden adaptar fácilmente para esta aplicación.
MUNE y CMAP son medidas clínicamente relevantes con frecuencia utilizados en estudios de investigación y en el seguimiento de pacientes con trastornos neuromusculares tales como ALS y la atrofia muscular espinal (SMA) 9, 10. Por ejemplo, en SMA, CMAP y MUNE se correlacionan bien con la edad, la gravedad y clínica medidas de la función 10-14. Ambas medidas son mínimamente invasiva y permiten la evaluación de la función longitudinalmente en el mismo individuo. Es importante destacar que estas medidas no pueden medir la activación o reclutamiento de la unidad de motor por las neuronas motoras corticales, pero proporcionar una evaluación clínicamente relevantes de la integridad de la neurona motora y su contraparte funcional, la unidad de motor.
Los modelos animales de enfermedad neuromuscular son esenciales para una comprensión de los mecanismos patogénicos de la enfermedad humana y para el desarrollo preclínico de agentes terapéuticos potencialmente eficaces. La capacidad de traducir las medidas de resultado y biomarcadores que pueden serutilizado en todas estas especies pueden facilitar y acelerar la traducción de los resultados preclínicos prometedores a los ensayos clínicos en humanos. Varios grupos han utilizado previamente ambas mediciones electrofisiológicas y de fuerza (mecánicos) para estimar la función de la unidad de motor en modelos de ratón 2-4, 15-22. Debido a la relativa complejidad de las medidas, hemos refinado estas técnicas en un formato visual para permitir el uso y la aplicación más extendida en ratones. El formato de vídeo de demostración e instrucción, permite pasos clave del procedimiento a destacar y peligros potenciales que deben abordarse. La aplicación de estas técnicas a las pruebas preclínicas de potenciales terapias en enfermedades de las neuronas motoras puede mejorar la traducción de terapias putativos de los ratones a la enfermedad humana.
Hay varios pasos críticos en el proceso de adquisición de las respuestas CMAP y MUNE. Colocación de los electrodos de grabación adecuado y consistente y suficiente contacto del electrodo con la ciervalas extremidades son críticos para la medición reproducible de amplitud y para disminuir el ruido de fondo. Por lo tanto, el contacto cercano entre las traseras de la piel de las extremidades y los electrodos debe ser confirmado de forma coherente. Hemos encontrado que los electrodos de superficie ofrecen grabaciones más consistentes CMAP y MUNE que los electrodos de aguja. Debido a los tejidos subcutáneos muy delgados, pequeños movimientos de superficie de grabación de la aguja puede dar lugar a una amplia variación en amplitudes CMAP. Además, el carácter más invasivo de electrodos de aguja no es óptimo para ratones recién nacidos o estudios longitudinales debido a la interrupción potencial muscular y lesiones. Una desventaja potencial de los electrodos de superficie, grabaciones no selectivos se refiere a la posibilidad de resolución fenotipo disminuida si un músculo en particular es más o menos involucrados en comparación con otro, y esto ha sido reportado en un modelo de ratón ALS 21.
Adquirir el tamaño medio SMUP es técnicamente más difícil en comparación con la CMAP. Debido a los respons más pequeñostamaño de correo (en el rango de mV en lugar de mV) el ruido de fondo puede ser más problemático. El ruido de fondo puede reducirse mediante el ajuste del electrodo de tierra, cátodo, ánodo, y el control de otro equipo eléctrico cerca de la configuración experimental. Una jaula de Faraday, normalmente utilizado para aplicaciones de electrofisiología intracelulares, no es necesario. Determinación visual de las respuestas individuales SMUP es la habilidad más difícil de adquirir y requiere práctica para obtener resultados consistentes con repetibilidad adecuada. Es importante asegurarse de que los SMUPs que están siendo registrados inician dentro de la duración de la respuesta CMAP máxima. Hemos definido los criterios para la aceptación de las respuestas incrementales individuales para hacer este proceso más sencillo de realizar y para aumentar la fiabilidad intra e inter-evaluador.
Una desventaja potencial de la técnica incremental de MUNE incluye la posibilidad de sobreestimar el número de unidades motoras funcionales debido a la alternancia de motor unidades. Hemos utilizado una técnica similar a Shefner et al. en que cada respuesta debe ser reproducible visto un total de 3 veces para reducir el impacto de este fenómeno 3.
En nuestra experiencia, los sistemas de electrodiagnóstico clínicos están optimizados para los estudios descritos en este documento debido a la mejora de la ergonomía de la interfaz del sistema-examinador electrodiagnóstico permitiendo facilidad de control. El sistema de dos canales utilizados en nuestro laboratorio está equipado con dos canales no conmutada amplificador utilizando un amplificador con 24 bits convertidor analógico a digital y una tasa de muestreo de 48 kHz por canal. Ganancia de hardware se puede ajustar desde 10nV a 100 mV / división. El filtro de baja frecuencia tiene un rango de 0,2 Hz-5 kHz, y la configuración del filtro de alta frecuencia va desde 30 Hz-10 kHz. Un estimulador de corriente constante se utiliza (intensidad: 0-100 mA; duración: 0,02-1 ms). La mayoría de los sistemas clínicos tienen características similares apropiados y se pueden ajustar para registrar adecuadamente las respuestas CMAP y MUNE. LAdicionalmente, plataformas electrofisiológicas estándar se pueden montar para registrar adecuadamente CMAP y MUNE, pero la interfaz puede ser necesario ajustar la facilidad de ajuste de la estimulación y la rápida identificación de las respuestas CMAP y SMUP.
Hemos utilizado anteriormente las técnicas de la CMAP y MUNE descrito aquí para permitir una evaluación rápida y reproducible del ciático músculo inervado de la extremidad posterior en ratones durante el periodo postnatal temprano a la edad adulta 5. Estas técnicas permiten la evaluación en modelos de ratón, cuando las pruebas de comportamiento para el funcionamiento del motor no es posible o es menos fiable. La aplicación de esta técnica a ratones recién nacidos facilita el estudio del desarrollo de unidades motoras y tiene el potencial de ampliar nuestra comprensión de la inervación de las neuronas motoras y la poda. Por ejemplo, hemos demostrado que el número de unidades motoras funcionales grabadas con MUNE se incrementará durante la poda de polyneuronal a la inervación mononeuronal durante las dos primeras semanass de la vida en ratones recién nacidos 5. La capacidad para poner a prueba los ratones durante largos períodos de tiempo con esta técnica se presta al estudio de la respuesta de la unidad de motor a la lesión del nervio periférico, trastornos neuromusculares hereditarias y el envejecimiento.
The authors have nothing to disclose.
WDA is supported by grant funding from NIH-NICHD (5K12HD001097-17) and Cure SMA. SJK is supported by grant funding from NINDS (K08NS067282 and U01NS079163).
Pro trimmer Pet Grooming Kit | Oster | 078577-010-003 | clippers for hair removal |
Synergy T2 EMG system | Natus Neurology | Model no longer available | portable electrodiagnostic system |
monopolar needles 28 gauge | Teca | 017K121 | cathode and anode stimulating electrodes |
Alpine Biomed Digital Ring Electrode with twisted wires and 1.5 mm TP connectors. | Alpine Biomed | 9013S0312 | recording electrodes |
Helping Hands alligator clip with iron base | Radio Shack | 64-079 | Maintaining recording electrode placement |
Spectra 360 Electrode Gel | Parker Laboratories | 9013G5012 | applied to reduce skin impedance |
monoject curved tip irrigating syringe | Covidien | 81412012 | utilized for application of electrode gel |
EMG needle cable | Teca | 902-RLC-TP | to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator |
Disposable 2" x 2" Electrode or similar trimmed as needed | Carefusion | 019-415000 | ground electrode |
Small Heating Plate with built-in RTD sensor, 15x10cm | World Precision Instruments | 61830 | warming plate used with animal temperature controller to transmit heat to animal |
Silicone pad for use with ATC2000 | World Precision Instruments | 503573 | conductive removable pad to cover warming plate for easy cleaning |
Animal temperature controller | World Precision Instruments | ATC2000 | low noise animal heating system for maintaining animal temperature |
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment | Puralube | 26870 | applied during anesthesia to avoid corneal injury |