Aislamiento de leucocitos de la interfaz humana Materno-fetal

El embarazo se caracteriza por tres fases distintas inmunológicos: 1) la implantación y placentación temprana asociada con una respuesta pro-inflamatoria (es decir, la implantación se asemeja a una "herida abierta"); 2) el segundo trimestre y la mayor parte del tercer trimestre del embarazo cuando se logra la homeostasis inmune a través de un estado predominantemente anti-inflamatoria en la interfase materno-fetal; y 3) el parto, un estado pro-inflamatorio ^1-7. Las células inmunes juegan un papel importante en la regulación de la respuesta inflamatoria en la interfase materno-fetal, donde su abundancia y el cambio de localización durante todo el embarazo ^6-9.

En los seres humanos, la interfaz materno-fetal representa un área de contacto directo entre los tejidos materna (decidua) y fetal (corion o trofoblasto). Esta interfaz incluye: 1) la decidua parietal que recubre la cavidad uterina no cubierto por la placenta y es en yuxtaposiciónpara el corion leve; y 2) la decidua basal, que se encuentra en la placa basal de la placenta donde es invadida por los trofoblastos intersticiales ¹⁰ (Figura 1). La intimidad de estas zonas de contacto crea condiciones para la exposición antigénica fetal al ^11-13 materna sistema inmunológico. No es sorprendente, los leucocitos comprenden hasta el 30-40% de las células deciduales ^8,9,14,15 además de las células de tipo estromal típicos y células glandulares ^8,14,16. El papel de los leucocitos en la interfase materno-fetal abarca múltiples procesos que incluyen la limitación de la invasión trofoblástica ^17, la remodelación de las arterias espirales ^18,19, el mantenimiento de la tolerancia materna ^12,20, y el inicio del trabajo ^21-26. Los leucocitos tanto de la adaptación y las extremidades innata del sistema inmune, es decir, las células T, macrófagos, neutrófilos, células B, células dendríticas, y células NK, se han identificado en los tejidos deciduales, y suproporciones y estado de activación se ha demostrado que variar espacialmente y temporalmente durante toda la gestación ^{6-10,12,14,24,27-30.} Las perturbaciones en la población y / o la función de leucocitos están asociados con el aborto espontáneo ^{31, 32} preeclampsia, restricción del crecimiento intrauterino ^32,33, y trabajo de parto prematuro ^7,24. Por lo tanto, el estudio de las características fenotípicas y la funcionalidad de los leucocitos en la interfase materno-fetal humano facilitará la elucidación de las vías inmunológicas dysregulated en los trastornos del embarazo.

Una de las herramientas más poderosas utilizadas para determinar el fenotipo y las propiedades funcionales de los leucocitos se citometría de flujo, la tecnología que permite el análisis cuantitativo de múltiples parámetros simultáneamente ^34-36. Para analizar los leucocitos por citometría de flujo, se requiere aislamiento de los leucocitos en una suspensión de una sola célula. Por lo tanto, un método para separar la infiltración leuSe necesita kocytes desde la interfaz materno-fetal para estudiar su fenotípica y propiedades funcionales.

Varios métodos han sido descritos para aislar los leucocitos desde la interfaz materno-fetal humano ^{10,14,25,27,37-39.} Mientras que algunos se aplican desagregación mecánica ^10,25,27,38, otros utilizan digestión enzimática ^37,40 para la disociación de tejido. Debido a la desagregación mecánica produce un menor rendimiento y reducción de la viabilidad ^41, y la disociación enzimática puede afectar a la viabilidad y la retención de marcador de superficie celular ^42, el método descrito en el presente documento combina la disociación mecánica suave con enzimático pre-tratamiento para aumentar el rendimiento de los leucocitos aislados sin comprometer la viabilidad celular. Una combinación similar de métodos ha demostrado ser eficaz en el aislamiento de leucocitos de los tejidos deciduales en la interfase materno-fetal ^39. Por lo tanto, el protocolo descrito en este documento implica mechadesagregación nica con un disociador tejido automático que aumenta la consistencia, mientras que el ahorro de tiempo y mano de obra en comparación con picado tradicional con escalpelos opuestas, hojas de afeitar o tijeras quirúrgicas ^10,28. La enzima seleccionada para la disociación del tejido era Accutase. A diferencia colagenasa utilizada ^43, Dispasa ^{44, 45} y tripsina, Accutase (una solución desprendimiento celular) combina proteolítica general y actividades colagenolíticas que contribuyen a la disociación eficiente pero suave ^46,47. Después de la disociación, los leucocitos se enriquecen a partir de la población total de las células deciduales por centrifugación en gradiente de densidad. Varios medios de gradiente de densidad se han utilizado previamente, el más común de los cuales son Percoll (una suspensión de partículas de sílice coloidal) y Ficoll ⁴⁸ (un polímero de sacarosa con un alto peso molecular sintético) ^49. La eficacia superior de aislamiento por el polímero sacarosa ha sido Previously muestra ^50, y el protocolo descrito en el presente documento además demuestra que este medio de gradiente de densidad produce una pureza suficientemente alta de los leucocitos mononucleares.

Por lo tanto, el protocolo descrito en el presente documento combina la desagregación tisular mecánico con un disociador automática tejido, la digestión enzimática con una solución de desprendimiento celular, y la separación de leucocitos con un medio de gradiente de densidad (1,077 + 0,001 g / ml) para aislar los leucocitos de tejidos deciduales humanos. Este protocolo se ha demostrado para preservar los antígenos de superficie celular, junto con la viabilidad celular. Los leucocitos aislados se pueden utilizar para múltiples aplicaciones que incluyen inmunofenotipo con citometría de flujo y estudios funcionales in vitro.