Isolement des leucocytes à partir de l'interface humaine materno-fœtale

La grossesse est caractérisé par trois phases distinctes: une immunologiques) implantation et la placentation précoce associée à une réponse pro-inflammatoire (par exemple, implantation ressemble à un «plaie»); 2) le deuxième trimestre et la plupart du troisième trimestre de la grossesse, lorsque l'homéostasie immunitaire est atteint grâce à un état majoritairement anti-inflammatoire à l'interface materno-fœtale; et 3) la parturition, un état ​​pro-inflammatoire ^1-7. Les cellules immunitaires jouent un rôle important dans la régulation de la réponse inflammatoire à l'interface materno-fœtale où leur abondance et le changement de localisation pendant la grossesse ^6-9.

Chez les humains, l'interface materno-fœtale représente une zone de contact direct entre la mère (caduque) et foetale (chorion ou trophoblaste) tissus. Cette interface comprend: 1) la caduque pariétale qui tapisse la cavité utérine ne sont pas couverts par le placenta et est en juxtapositionau laeve de chorion; et 2) les caduque basale, situé dans la plaque basale du placenta où il est envahi par les trophoblastes interstitiels ¹⁰ (Figure 1). L'intimité de ces zones de contact crée les conditions pour l'exposition du fœtus à l'antigénique immunitaire ^11-13 du système maternelle. Sans surprise, les leucocytes comprennent jusqu'à 30 à 40% des cellules déciduales ^8,9,14,15 en plus des cellules de type stromal typiques et les cellules glandulaires ^8,14,16. Le rôle des leucocytes à l'interface materno-fœtale englobe de multiples processus qui incluent la limitation de l'invasion trophoblaste ^17, le remodelage des artères spiralées ^18,19, maintien de la tolérance maternelle ^12,20, et l'initiation du travail ^21-26. Les leucocytes à la fois de l'adaptation et des membres innée du système immunitaire, à savoir, les cellules T, les macrophages, les neutrophiles, les lymphocytes B, les cellules dendritiques et les cellules NK, ont été identifiés dans les tissus déciduales, et leurIl a été démontré proportions et l'état d'activation de varier spatialement et temporellement pendant toute la gestation ^{6-10,12,14,24,27-30.} Perturbations dans la population et / ou de la fonction des leucocytes sont associés à un avortement spontané ^{31, 32} pré-éclampsie, une restriction de croissance intra-utérin ^32,33 et ^7,24 travail prématuré. Par conséquent, l'étude des caractéristiques phénotypiques et la fonctionnalité des leucocytes à l'interface materno-fœtale humaine facilitera l'élucidation des voies immunologiques surexprimés dans les troubles de la grossesse.

Un des outils les plus puissants utilisés pour déterminer le phénotype et les propriétés fonctionnelles de leucocytes est la cytométrie de flux, une technologie qui permet l'analyse quantitative de plusieurs paramètres simultanément ^34-36. Pour analyser les leucocytes par cytométrie de flux, l'isolement des leucocytes dans une suspension à cellule unique est nécessaire. Par conséquent, un procédé pour séparer l'infiltration leukocytes de l'interface materno-fœtale est nécessaire pour étudier leur propriétés phénotypiques et fonctionnels.

Plusieurs méthodes ont été décrites pour isoler les leucocytes de l'interface materno-fœtale humaine ^{10,14,25,27,37-39.} Alors que certains appliquent désagrégation mécanique ^10,25,27,38, d'autres utilisent la digestion enzymatique ^37,40 pour la dissociation des tissus. Parce que la désagrégation mécanique produit un rendement plus faible et la viabilité réduite ^41, et la dissociation enzymatique peut affecter la viabilité et la surface de la cellule marqueur rétention ^42, le procédé décrit ici combine dissociation mécanique douce avec prétraitement enzymatique pour augmenter le rendement des leucocytes isolés sans compromettre la viabilité des cellules. Une combinaison de méthodes similaire a été démontrée comme étant efficace dans la séparation de leucocytes à partir des tissus déciduales à l'interface materno-fœtale ^39. Par conséquent, le protocole décrit ici implique mécadésagrégation nique avec un dissociateur automatique de tissu qui augmente la cohérence tout en économisant du temps et de la main-d'œuvre par rapport à hachage traditionnel avec des scalpels opposées, lames de rasoir, des ciseaux chirurgicaux ou ^10,28. L'enzyme choisie pour la dissociation des tissus était Accutase. Contrairement à la collagénase utilisée par ^{43, 44} dispase, la trypsine et ^45, Accutase (une solution de détachement cellulaire) combine à la fois des activités protéolytique et collagénolytiques général qui contribuent à la dissociation efficace et doux ^46,47. Après dissociation, les leucocytes sont enrichies à partir de la population totale des cellules déciduales par centrifugation en gradient de densité. Différents milieux de gradient de densité ont été utilisés précédemment, le plus commun qui sont Percoll (une suspension de particules de silice colloïdale) ⁴⁸ et Ficoll (un polymère de saccharose avec un poids moléculaire synthétique de haute) ^49. L'efficacité supérieure de l'isolement par le polymère de saccharose a été previoisa nt montré ^50, et le protocole décrit ici encore prouve que ce média de gradient de densité produit une pureté suffisamment élevé de leucocytes mononucléaires.

Par conséquent, le protocole décrit ici combine la désagrégation du tissu mécanique avec un dissociateur automatique de tissu, la digestion enzymatique avec une solution de détachement de la cellule, et la séparation des leucocytes avec un milieu de gradient de densité (1,077 + 0,001 g / ml) pour isoler les leucocytes à partir de tissus déciduales humaines. Ce protocole a été prouvé pour préserver les antigènes de surface des cellules ainsi que la viabilité des cellules. Les leucocytes isolés peuvent être utilisés pour de multiples applications qui comprennent immunophénotypage avec la cytométrie de flux et des études fonctionnelles in vitro.