유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가
Özet
Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.
Abstract
(황 및 질소 겨자 등의 알킬화 화학 전쟁 에이전트 포함) 화학 물질에 노출되면 상처 치유 장애를 포함하여 임상 증상의 과다 발생합니다. 상처 치유의 생리 학적 과정은 매우 복잡하다. 어느 혈관 생성을 통한 (신규 형성) 또는 혈관 생성 (기존 용기의 돋) – 육아 조직의 형성은 예비 상처 봉합의 결과 및 새로운 모세 혈관의 네트워크가 제공하는이 과정에서 중요한 단계이다. 모두 vasculo- 및 혈관 내피 세포의 기능, 지시 마이그레이션을 필요로한다. 따라서, 초기 내피 세포 (EEC) 이전의 조사는 잠재적으로 치료 개입을위한 새로운 전략을 확인 장애를 치유 화학 물질에 의한 상처의 병태 생리를 이해하고하는 것이 중요하다.
우리는 에이전트 노출을 알킬화 후 손상된 상처 치유를 평가하고, TR에 대한 잠재적 인 후보 화합물을 테스트eatment. 우리는이 프로토콜에 설명 된 기법들을 사용 하였다. 수정 된 보이든 챔버는 정량적 EEC의 chemokinesis 설명한다보고자 하였다. 더욱이, 정 성적으로 마이그레이션을 평가하기 위해 트랙 분석과 조합하여 분석 상처 치유의 사용이 예시된다. 마지막으로, 우리는 교란 된 세포 이동의 기본 메커니즘을 식별하는 미토콘드리아 막전위의 조사 TMRM 형광 염료의 사용을 입증한다. 다음 프로토콜은 EEC의 조사를 위해 적응 된 기본 기술에 대해 설명합니다.
Introduction
세포 이동은 피부 손상 후 개발, 각종 질병 및 상처 치유 등 많은 생리 및 병리 생리 학적 과정에 중요하다.
피부 손상에 따라, 염증은 손상 또는 괴사 조직과 육아 드라이브를 예비 상처 봉합을 제거하고 혈관 생성을 통해 새로운 모세 혈관의 네트워크 형성 (소설 형성) 또는 혈관 신생 (기존 소포의 발아) 1-3 수 있습니다. 모두 vasculo- 및 혈관 내피 세포의 이동을 필요로한다. 혈관의 네트워크가 증가하는 궁극적 각질화를 받아야 각질 세포 증식에 산소와 영양분을 운반하는 것이 필수적이며, 새로운 상피를 형성하고 상처 봉합을 제공한다.
내피 세포의 손상 마이그레이션 장애 4,5 상처 치유의 근본 원인이다. 초기 내피 세포의 따라서, 방법을 평가하기 위해 마이그레이션 pathophysiol을 탐구하는 데 필요한세포 이동이 ogy 질환 및 치료 개입을위한 새로운 전략을 확인한다.
알킬화제 (예를 들면, 황 및 질소 머스타드)에 피부 노출 장애 (6) 상처 치유됩니다. 이러한 화합물로 인해 정치적으로 불안정한 지역과 비교적 간단한 합성의 기존 비축에 강한 우려에 대한 이유를 20 세기에 여러 갈등 화학 전쟁 에이전트로 사용 남아 있었다. 황 머스타드 먼저 1822 년 합성되었지만, SM 노출의 분자량과 임상 병리학 상세히 이해되지 않고 SM 노광용 해독제가 확인되지 않았다.
몇몇 연구는 이해하고 SM 노광 후에 손상된 상처 치유를 모델링하고 그 효과를 확보 할 수있는 잠재적 후보 화합물을 시험하기 위해 수행되었다. 슈미트 외. (2009) 클로 람 부실의 영향, 양해 각서 (MOU)에 SM과 유사한 특성을 가진 알킬화 화합물을 테스트SE 배아 체 모델 및 혈관 형성 7 극적인, 때때로 99 % 이상의 감소를 알았다. 이 부작용은 대부분, 생리 학적 조건 하에서, 증식 및 혈관 내피 전구 세포의 이동에 의해 지배된다 개발 단계에서 두드러졌다. 따라서, 이들 세포는 알킬화제에 특히 민감한 것으로 확인되었다. Steinritz 외. (2010)에, 마우스 배아 체 모델에서 특히 SM 독성을 감소시키는 그들의 능력에 대하여 특히, N- 아세틸 시스테인 (NAC)과 알파 리놀렌산 (ALA)에서 반응성 산소 종 (ROS)의 청소부 테스트 혈관 형성 (8)를 복원합니다. 임시 보호 효과는 과도한 활성 산소의 형성은 상처 치유에 SM의 부작용에 기여할 가능성이되었음을 나타내는, 관찰되었다. 이러한 효과는 영구 없었고 두 후보 화합물은 장기 8에서 혈관 형성 및 상처 치유를 복원 할 수 없을 수도있다. HoweveR, 그 실험은 세포 이동의 조사를 허용했다 복잡한 3D 모델에서 실시 하였다. 따라서, 우리는 이후 용기 (9)의 형성 과정에서 중요한 역할을 EEC의 세포 이동에 대한 유익한 효과에 대한 ALA NAC 및 시험.
또한, 셀 극성 세포 이동을 위해 필요하다는 증거가있다. ROS의 형성으로 이어지는 미토콘드리아 기능 장애 세포 극성을 저해하는 것으로하고, 따라서 악영향 세포 이동에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 미토콘드리아 기능에 관한 라이브 세포 이미징을 수행하고, ROS 제거제의 효과를 조사 하였다. 다음 프로토콜은 EEC, 보이든 챔버 분석, 세포 추적 분석 및 세부에서 미토콘드리아 기능의 평가 TMRM의 사용을 포함하여 분석 상처 치유의 재배에 대한 일반 요구 사항에 대해 설명합니다. EEC 재배 및 마이그레이션을위한 실험 프로토콜의 중요한 측면이 강조된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
독성 화학 물질에 대한 피부 노출은 종종 심한 상처 치유에 장애를 초래한다. 기본 메커니즘은 크게 알려져 있지 않다. 상처 치유는 서로 다른 단계 (지혈, 염증, 증식 및 리모델링)로 구성된 복잡한 과정이다. 세포 이동은 그러나, 육아 조직의 형성에 가장 중요하고, 모든 단계에 관여한다. 여기서, 새로운 혈관은 혈관 형성 또는 angio- 의해 하나 형성된다.
두 과정은 전구체 및…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).
Materials
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well – 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
Referanslar
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration – Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
