Comet Assay als ein indirektes Maß für Systemische Oxidativer Stress
Özet
Comet Assay misst DNA-Brüche, durch verschiedene Faktoren hervorgerufen. Wenn alle Faktoren (außer oxidativer Stress) DNA-schädigenden konstant gehalten werden, die Menge an DNA-Schädigung ist eine gute indirekte Parameter von oxidativem Stress. Das Ziel des Protokolls ist es, Comet-Assay zur indirekten Messung von oxidativem Stress zu verwenden.
Abstract
Höheren eukaryotischen Organismen nicht ohne Sauerstoff leben; Paradoxerweise kann Sauerstoff für sie schädlich sein. Das Sauerstoffmolekül chemisch relativ inert, weil es zwei ungepaarten Elektronen in verschiedenen pi * Anti-Bindungsorbitalen entfernt. Diese beiden Elektronen parallel Spins, das heißt sie in der gleichen Richtung um ihre eigenen Achsen drehen. Deshalb ist die Sauerstoffmoleküls ist nicht sehr reaktiv. Aktivierung von Sauerstoff kann durch zwei verschiedene Mechanismen auftreten; entweder durch Reduktion über ein Elektron zu einem Zeitpunkt (monovalent Reduktion) oder durch die Absorption von genügend Energie, um den Spin eines der ungepaarten Elektronen umzukehren. Dies resultiert in der Produktion von reaktiven oxidativen Spezies (ROS). Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten, wie der menschliche Körper eliminiert ROS in seinen physiologischen Zustand. Wenn ROS-Produktion übersteigt die Reparaturkapazität, oxidativer Stress Ergebnisse und Schäden unterschiedlichen Molekülen. Es gibt viele verschiedene Methoden, mit denen oxidativer Stress kann mich seingesicherter. Diese Handschrift konzentriert sich auf eine der Methoden namens Zell Gelelektrophorese, die auch als "Comet Assay", die Messung der DNA-Brüche ermöglicht bekannt. Wenn alle Faktoren bekannt, DNA-Schädigung, ausgenommen oxidativen Stress verursachen konstant gehalten werden, die Menge an DNA-Schädigung durch Comet-Assay gemessen wird, ein guter Parameter für oxidativen Stress. Das Prinzip ist einfach und beruht auf der Tatsache, dass DNA-Moleküle, sind negativ geladen. Ein intakter DNA-Molekül hat eine so große Größe, die nicht während der Elektrophorese nicht migrieren. DNA-Brüche, jedoch falls vorhanden führen zu kleineren Fragmenten, die im elektrischen Feld zur Anode hin bewegen. Kleinere Fragmente wandern schneller. Die Fragmente unterschiedliche Größen für das Ergebnis der Elektrophorese ist keine klare Linie, sondern ein Kontinuum mit der Form eines Kometen. Das System ermöglicht eine Quantifizierung der resultierenden "Komet" und damit der DNA-Brüche in der Zelle.
Introduction
Comet Assay wurde zuerst von schwedischen Wissenschaftlern Ostling und Johanson 1 entwickelt. DNA ist ein negativ geladenes Molekül. Während der Elektrophorese, kleiner, beschädigte DNA-Fragmente zu reisen schneller zu einer positiv geladenen Anode 2. Je kleiner die DNA-Fragmente, desto schneller wird die Migration in Richtung der Anode eine typische "Komet" mit einem "Kopf" von intakten, unbeschädigte DNA und einem "Schwanz" der beschädigten DNA-Fragmente 3 zusammengesetzt, um zu bilden. Beschädigte DNA kann durch verschiedene Mechanismen im Körper 4, der die Erzeugung von DNA-Brüchen relativ ausgewogen 5 halten repariert werden. Wenn jedoch das Gleichgewicht zugunsten der DNA Pausen können die Brüche ansammeln und wird schließlich zu der Entwicklung einer Krankheit beitragen.
Unsere DNA leidet etwa 0.000165% Schädigung zu einer gegebenen Zeit 6. Einzelsträngige DNA-Brüche beziehen sich auf einen Defekt an einem der beiden Stränge der DNA-Doppelhelixwohingegen doppelsträngige DNA-Brüche verursacht werden, wenn beide Stränge der DNA-Doppelhelix beschädigt sind. Es gibt verschiedene Faktoren, die die Menge an DNA-Brüche zu einem gegebenen Zeitpunkt wie das Alter der Zelle, Zigarettenrauch, verschiedene Medikamente oder oxidativen Stress 7-9 erhöhen kann. Wenn alle Faktoren, die zu einer verbesserten DNA-Brüche konstant gehalten werden, dann wird die Quantifizierung von DNA-Brüchen mittels Comet-Assay ist eine gute indirekte Parameter des oxidativen Stresses.
Das Verfahren zur Comet-Assay wird heute zunehmend in der Medizin einschließlich der Augenheilkunde eingesetzt. Ein Grund dafür ist, dass oxidativer Stress mehr als Pathomechanismus für verschiedene Krankheiten, 8-11 und Comet-Assay erfasst ist eine Methode, mit der oxidativen Stress indirekt quantifiziert werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Schwedische Wissenschaftler Ostling und Johanson als erste in ihrem Bereich zu Comet-Assay verwenden, um DNA-Schäden in Zellen 1 zu quantifizieren. Die neutralen Bedingungen, dass die beiden Wissenschaftler nutzten jedoch nur erlaubt den Nachweis von doppelsträngigen DNA-Brüche. Singh et al. Später angepasst den Test für den Einsatz unter alkalischen Bedingungen, die eine empfindliche Version, die Doppel- und Einzelstrang-DNA-Brüche zu bewerten und erkennen alkalilabile Websites 12 könnte hergestellt. Seit der ersten Entwicklung hat der Assay bei verschiedenen Schritten verändert wurde, um für die Bewertung Arten von DNA-Schädigung in verschiedenen Zelltypen 13-15 geeignet zu machen.
Wie bei allen Techniken ist wichtig, zahlen viel Liebe zum technischen Details, um genaue Ergebnisse zu erhalten 16. Basierend auf unserer Erfahrung, die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn jeder Verfahrensschritt-Lösung von der Vorbereitung bis zur Kometen-Quantifizierung von Experten Labor techn geführticians. Die Verwendung von frischen und richtig vorbereitet Medien, angemessene Pipettiertechniken, exaktes Timing und (wie zuvor im Ergebnisteil erwähnt) die Verwendung von frisch zubereiteten Leukozyten sind von wesentlicher Bedeutung, um für die Lyse und Gelelektrophorese, um genaue Ergebnisse zu erhalten 17.
All die einzelnen Schritte in diesem Test sind für den Erhalt zuverlässige Ergebnisse ebenso wichtig. 16 In der Regel die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn jeder einzelne Verfahrensschritt aus der Lösung Vorbereitung bis Kometen Quantifizierung wird von Experten Labor technicians.Important geführt scheint die Verwendung von frischen und richtig vorbereitet Medien , angemessene Pipettiertechniken, exaktes Timing und wie bereits im Ergebnisteil der Einsatz von frisch zubereiteten Leukozyten für die Lyse und Gelelektrophorese, angemessene Ergebnisse aus dem Test 17 zu erhalten bezeichnet.
Wie andere Methoden, hat die Comet-Assay-Technik seine ADVANteile und Nachteile. Als eine empfindliche Methode ist der Test anfällig für Faktoren (zB UV-Licht), die DNA-Brüche ergänzen und beeinflussen so Ergebnisse könnten. Jeder Faktor, erhöhen kann oxidativer Stress, außer der, die erforscht wird, sollte vermieden werden. Stressoren können Niveau von oxidativem Stress nicht nur in Leukozyten, sondern auch in allen anderen Blut Medien und Lymphozyten zu erhöhen. Wie bereits erwähnt gibt es viele verschiedene und direktere Methoden zur Messung der oxidativen Stress 18,19. Comet-Assay ist einer der vielen Methoden, die bestimmte Vorteile hat. Dazu gehören ihre relativ geringen Kosten, der geringen Anzahl von Zellen erforderlich ist (<10.000 Zellen) und damit die kleine Proben von Blut pro Patient benötigt, die relativ kurze Zeitdauer erforderlich ist, um DNA-Schäden in Zellen (etwa 3 Tage) zu quantifizieren, dessen Empfindlichkeit und seine weit verbreitete Anwendbarkeit auf Eseln DNA-Schäden in verschiedenen Zelltypen. In der Vergangenheit wählen wir mit Leukozyten zu arbeiten, da wir hatten Erfahrung mit diesemZelltyp und es war zutreffend für den jeweiligen geplanten Studie. Ein weiterer Vorteil der Comet-Assay ist, dass es verwendet werden kann, um verschiedene Arten und Mengen an DNA-Schäden zu erkennen und kann somit in verschiedenen anderen Bereichen des Studiums neben oxidativen Stress, wie DNA-Reparatur Studien Supplementierung Versuche oder Genotoxizität Studien angewendet werden.
Oxidativer Stress gilt heute als spielen eine kritische Rolle bei der Pathogenese mehrerer Krankheiten erkannt. Comet-Assay-Methode, wobei eine von vielen Möglichkeiten der Messung von oxidativem Stress 18,19, ist relativ einfach, vielseitig und kostengünstig. Wenn beherrscht, kann dieses Verfahren in allen Bereichen der Medizin, bei denen oxidativer Stress eine Rolle spielt 8-10,20,21 verwendet werden.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten die LHW Stiftung zu danken, in Triesen Liechtenstein, für die finanzielle Unterstützung unserer Forschung auf oxidativen Stress.
Materials
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Qualigens | (CPW59) | |
| Disodium EDTA | HiMedia | (RM1370) | |
| Ethidium Bromide | Sigma | (E-8751) | |
| Histopaque | Sigma | (1077-1) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) | HiMedia | (TS1006) | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Ranbaxy Rankem | (S0160) | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | BDH-Merck | (89021) | |
| Triton X-100 | HiMedia | (RM 845) | |
| Trizma Base | Spectrochem | ||
| Materials required for gel electrophoresis | |||
| Normal Melting Agarose (NMA) | HiMedia | (RM273) | |
| Low Melting Point Agarose (LMPA) | Sigma | (A9414) | |
| Methanol – Qualigens | |||
| Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) | Blue Star | ||
| Microcentrifuge Tubes | Tarsons | (500010) | |
| Micropipettor and Tips | Tarsons | ||
| Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides |
Referanslar
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