Comet Assay comme une mesure indirecte de stress oxydatif systémique

Les études sur test des comètes effectuées à l'Université de Bâle, Département d'ophtalmologie ont été approuvés par le comité d'éthique local de Bâle 1. Préparation des réactifs Préparer saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (PBS) (Ca ++, Mg ++) solution par addition de PBS (1 paquet L) et 990 ml de dH 2 O aux médias. Ajuster le pH à 7,4. Stocker à température ambiante. Préparer la solution de lyse: Pour préparer 1000 ml ajoute 2,5 M de NaCl (146,1 g), de l'EDTA 100 mM (37,2 g) et 10 mM de base Trizma (1,2 g) dans de dH 2 O. Préparer tampon d'électrophorèse (NaOH 300 mM / EDTA 1 mM) en ajoutant 30 ml de NaOH 10 M et 7,5 ml de 0,2 M EDTA, QS 1500 DH 2 O et bien mélanger. Le volume total dépend de la capacité de la boîte à gel. Avant utilisation, mesurer le pH du tampon pour assurer un pH> 13. Préparez tampon de neutralisation contenant 0,4 M de Tris (48,5 g ajouté à dh ~ 800 2 O, ajuster le pH à 7,5), concentré (& #62; M HCl 10) dans 1000 ml avec dH 2 O. Conserver la solution à la température ambiante. Préparer la solution de coloration. Pour le bromure d'éthidium (EtBr; 10x Stock, 20 pg / ml) ajouter 10 mg de EtBr dans 50 ml dH 2 O et stocker à température ambiante. Pour 1x Stock – mélanger 1 ml avec 9 ml dH 2 O. PRUDENT! Manipuler avec précaution EtBr adéquate car il est un cancérogène connu. 2. Isolement de leucocytes Obtenir des échantillons de sang humain (20 ml) avec anti-coagulant tels que l'héparine en utilisant la ponction veineuse. Séparer les lymphocytes en utilisant un séparateur de cellules à gradient de densité tels que Histopaque. En bref, le sang dilué dans 1: 1 avec du PBS ou RPMI (sans FBS) et de la couche au-dessus de 600 ul de liquide de séparation de cellule. Centrifugeuse 1800 g pendant 20 min à 4 ° C. Aspirer le manteau 'Buffy' dans 3-5 ml de PBS / RPMI et centrifugé à 300 g pendant 10 min pour sédimenter les lymphocytes. Récupérer lymphocytes juste au-dessus limite entre PBS (RPMI) Et le liquide de séparation de cellules, à l'aide d'une pipette. Retirer les bandes de leucocytes à partir de l'interface entre le plasma et les couches de liquide de séparation de cellules de chaque tube et recueillir dans un tube de 50 ml. Amener le volume total à 50 ml avec du milieu Eagle modifié de froid Dulbecco (DMEM). Laver la suspension de cellules trois fois avec du DMEM à 300 xg pendant 10 min. Comptez le nombre total de cellules en utilisant un hémocytomètre. Suspendre les cellules dans PBS et aliquote dans des microtubes à 10 7 cellules / tube. Pipeter 0,4 ml de cellules dans un tube de matière plastique à usage unique de 5 ml. Ajouter 1,2 ml 1% d'agarose à faible température de gélification à 40 ° C. Mélanger et rapidement et pipeter 1,2 ml de suspension de cellules sur la surface d'agarose recouvert d'une lame de pré-enduit. Éviter de produire des bulles. Laisser la gélose se gélifier pendant environ 2 min. Soyez cohérent avec le temps et la température de gélification, et veiller à ce que l'agarose est entièrement réglé avant l'immersion dans une solution de lyse. Après pleinement set, plonger dans la solution de lyse à ~ 4 ºC. 3. Lyse et Électrophorèse NOTE: La procédure décrite est pour l'électrophorèse dans des conditions de pH> 13 alcalines. Après au moins 2 heures à ~ 4 ºC, retirez délicatement les lames de la solution de lyse. Placer les lames côte à côte sur la boîte de gel horizontal de près d'une extrémité, les glissant aussi rapprochés que possible. Remplir les réservoirs tampons avec fraîchement préparé tampon à pH> 13 d'électrophorèse jusqu'à ce que le niveau de liquide recouvre complètement les diapositives (éviter les bulles plus de l'agarose). Laissez-lames sont assis dans le tampon alcalin de 20 min pour permettre le déroulement de l'ADN et l'expression des dommages alcalin labile. Allumez alimentation de 25 volts (~ 0,75 V / cm) et ajuster le courant à 300 milliampères en élevant ou abaissant le niveau de tampon. Électrophorèse les diapositives pendant 30 min. Coupez l'alimentation. Soulevez doucement les lames de la mémoire tampon et pdentelle sur un plateau de vidange. Goutte à goutte enduire les lames avec neutralisation tampon. Laisser les lames reposer pendant au moins 5 min. Égoutter diapositives et répéter deux fois de plus. Colorer les lames avec 80 ul 1x bromure d'éthidium (BET) et laisser reposer pendant 5 min, puis tremper dans de l'eau distillée refroidie pour éliminer l'excès. Ensuite, placez une lamelle sur la lame et de les stocker immédiatement. Magasin glisse pendant un mois à température ambiante dans des conditions sèches. REMARQUE: Les autres taches d'ADN (par exemple, SYBR-green) peut également être utilisé. Attention! porter des gants de protection comme la plupart des colorants sont mutagènes. 4. Quantification des cassures de l'ADN Pour visualiser la lésion de l'ADN, observer la diapositive d'ADN coloré à l'EtBr sous un microscope à fluorescence objectif 40X. Évaluer quantitativement dommages à l'ADN dans les cellules en mesurant la longueur de migration de l'ADN et le pourcentage d'ADN migré (Figure 1A). Quantifier dommages à l'ADN (figure 1B) par le moment et Olive Queue-moment. Définitions de Queue-Moment et Olive -Moment ont déjà été donnés 8-10. NOTE: Dans notre expérience, il est suffisant pour tenir à l'un des paramètres. Les cellules sont photographiées en réglant l'outil automatisé qui analyse sur les cellules de diapositives et de photographies au microscope. Quantification des cassures de l'ADN peut être fait par des progiciels d'analyse d'image. Il existe plusieurs forfaits différents logiciels qui sont faits sur mesure pour capturer l'image des cellules et de quantifier les dommages à l'ADN. Nous vous recommandons d'utiliser le même logiciel pendant toute l'expérience. Le technicien de laboratoire identifie la cellule intacte ou d'une comète est marqué sur l'ordinateur et clique avec la souris sur elle. La cellule comète ou intacte est alors automatiquement marqué.