Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung der Maus Halslymphknoten
Özet
Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von Hochfrequenz-Ultraschall (HFUS) zum Abbilden der Maus Lymphknoten. Diese Technik optimiert die Visualisierung und Quantifizierung der zervikalen Lymphknoten-Morphologie, Volumen und Durchblutung. Bild-geführte Biopsie der Lymphknoten und Verarbeitung von Lymphgewebe zur histologischen Auswertung wird auch gezeigt.
Abstract
Hochfrequenz-Ultraschall (HFUS) wird weithin als eine nicht-invasive Methode zur Abbildung innerer anatomischer Strukturen in Kleintierversuchssystemen eingesetzt. HFUS hat die Fähigkeit, Strukturen so klein wie 30 & mgr; m zu erfassen, eine Eigenschaft, die für die Visualisierung oberflächlicher Lymphknoten bei Nagern in der Helligkeit (B) -Modus verwendet worden ist. Die Kombination von Power-Doppler mit B-Mode-Bildgebung ermöglicht die Messung von Kreislaufdurchblutung in Lymphknoten und anderen Organen. Während HFUS wurde für Lymphknotenbildgebung in einer Reihe von Mausmodellen verwendet, wurde ein detailliertes Protokoll beschreibt HFUS Bildgebung und Charakterisierung der Lymphknoten in Mäusen nicht beobachtet. Hier zeigen wir, dass HFUS angepasst werden, um zu detektieren und zu charakterisieren, Lymphknoten von Mäusen werden. In Verbindung B-Modus und Power-Doppler-Bildgebung kann zur Erhöhung der Blutfluss in immunologisch vergrößerten Halslymphknoten zu erkennen. Wir beschreiben auch die Verwendung von B-Bild, feine Nadelbiopsien der zervikalen Lymphknoten nicht durchführendes zu Lymphgewebe für die histologische Analyse abrufen. Schließlich werden softwaregestützte Schritte beschrieben, um Änderungen in Lymphknotenvolumen zu berechnen und um Änderungen in Lymphknoten Morphologie folgenden Bildrekonstruktion zu visualisieren. Die Fähigkeit, Veränderungen der zervikalen Lymphknoten Biologie über die Zeit visuell zu überwachen stellt eine einfache und leistungsfähige Technik für die nicht-invasive Überwachung der zervikalen Lymphknotenveränderungen in präklinischen Mausmodellen der Mundhöhle Krankheit.
Introduction
Lymphdrainage der interstitiellen Gewebsflüssigkeit ist die wichtigste Methode der Verbreitung von Infektions Mikroorganismen und Krebsarten, die sich in der Mund-Kiefer-Bereich 1,2. Klinische Prüfung von Lymphknoten ist eine gemeinsame diagnostischen Praxis verwendet, um das Vorhandensein oder das Fortschreiten von Krankheiten, die in der Mundhöhle stammen bestimmen. Dies unterstreicht die Bedeutung der Verwertungshalslymphknoten als wertvolle anatomischen Stellen für die orale Krankheitsdiagnose 3. Mehrere spezialisierte Abbildungsmethoden sind klinisch zur Identifizierung erkrankten Lymphknoten genutzt. Dazu gehören die Positronenemissionstomographie (PET), Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MR). Während sehr wertvoll, diese Verfahren erfordern alle umfangreiche Vorbereitung des Patienten, hochspezialisierte Ausrüstung und / oder chemischen Infusion in den Kreislauf zu ermöglichen oder verbessern den Bildgebungsprozess.
Sonographische Bildgebung (Ultraschall, US) ist eine häufig angewandte Technik verwendet werden, um im,Alter Lymphknoten präsentiert mit Lymphadenopathie infolge einer Infektion oder metastasierendem Beteiligung 4-6. US wird häufig mit PET-CT und MR-Bildgebung kombiniert werden, um eine umfassende Darstellung des Patienten Lymphknotenstatus liefern und helfen, Tumorstaging und Notwendigkeit für chirurgische Exzision 7 zu bestimmen. Die nicht-invasive Natur der US hat auch inhärente Vorteile gegenüber anderen Bildgebungsmodalitäten, einschließlich Benutzerfreundlichkeit, geringe Kosten, geringe Beschwerden des Patienten und Vorbereitung. Die oberflächliche subkutane Lage der meisten Lymphknoten erlaubt uns, minimal-invasive Feinnadelaspiration Biopsien mit erhöhter Genauigkeit zu führen, die Verbesserung der diagnostischen Genauigkeit 8.
Handelshochfrequenz (HF) US liefert detaillierte Auflösung der internen anatomischen Strukturen bis 30 um 9. Verwendung Wandlern reicht von 22 bis 70 MHz, HFUS wurde leicht auf eine Vielzahl von experimentellen Nagetier Systeme angewendet, um Echtzeit-Abbildung der inneren Organe in vivo zu ermöglichen.; HFUS wurde zur Visualisierung von Tumorbildung bei herkömmlichen Helligkeit (B) -Modus mit einer Reihe von allgemeinen und speziellen Kontrastverstärkung agents9 angepasst sowie. Verwenden von Power-Doppler mit HFUS bietet die Möglichkeit, den Blutfluss innerhalb der Maus Tumoren zu überwachen, so dass eine umfassende Bewertung der angiogenen Perfusion in lebenden Mäusen 10,11. HFUS wurde zur erkrankten Maus Lymphknoten innerhalb des Hauptkörperhöhle zu visualisieren, was zeigt, parallel Nützlichkeit dieser Technologie auf die klinische Praxis. Insbesondere entzündlichen und viszerale Metastasen Lymphknoten Änderungen wurden in Maus-Modellen von Krebs beherbergen Brust 12,13, Bauchspeicheldrüsen 14, colorectal 15 und 16 Lungentumoren sowie Faser histocytomas 17 und einen alten Mausmodell der erworbenen Hydronephrose 18 beobachtet . Diese Beispiele verfestigen den Wert HFUS als leistungsstarkes Ermittlungswerkzeug für die tumorinduzierte Lymphadenopathie in einer Vielzahl von rodent Systeme.
Mehrere Modelle von bakteriellen Infektionen 19,20 und Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) 21,22 wurden entwickelt, um diese Krankheiten in der präklinischen Einstellung zu studieren. Im Gegensatz zu Menschen, Mäuse enthalten drei Halslymphknoten, die Lymphe aus Geweben der Mundhöhle (Unterkiefer, Unterkiefer und Kieferspeichel oberflächliche Ohrspeichel 23) zu überblicken. Kürzlich haben wir die Verwendung von HFUS, um den Ort und die Morphologie dieser Lymphknoten abzubilden, Überwachen von Änderungen Lymphknotenvolumens und den Blutfluss in Karzinogen-induzierte Mausmodell HNSCC 24. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung HFUS zur Identifizierung, Bildgebung und Analyse von zervikalen Lymphknoten in lebenden Mäusen. Dieses Protokoll zeigt auch die Machbarkeit der Verwendung HFUS um bildgeführte Feinnadelbiopsie der erweiterten Maushalslymphknoten durchzuführen, so dass die histologische Überwachung von Veränderungen der zervikalen Lymphknoten Inhalt und Pathologien über time in dem gleichen Tier. Dieses Protokoll ist leicht an für die detaillierte Untersuchung der Halslymphknotenerkrankungen resultierende von jeder invasive Mundhöhle Krankheit bei Mäusen zu ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Visualisierung und in situ Auswertung murine Lymphknoten nicht-invasiv HFUS Bildgebung. Die Verwendung von B-Mode- und Doppler-Bildgebung Leistung zu visualisieren zervikalen Lymphknotens Morphologie bietet Volumen und Lymphknoten Blutfluß für eine experimentelle Analyse präklinischen Mausmodellsystemen ähnlich der für die Charakterisierung des zervikalen Knoten Patienten in der klinischen Praxis verwendet. Die Fähigkeit, die Cervial Lymphknoten über Feinnadelbiopsie überwachen stellt auch eine nützliche Technik zum Nachweis von Immunzellen Veränderungen und die Anwesenheit ausländischer Zelltypen oder Bakterien während der Mundhöhle Krankheit induzierte Lymphadenopathien bei Mäusen. Die einfache Handhabung und niedrige Kosten mit HFUS assoziiert ermöglicht das schnelle Screening von Gebärmutterhalskrebs Lymphknotenstatus in einer Vielzahl von Tiermodellen.
Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist das zunächst erfolgreicher Identifizierung der Lymphknoten in HFUS Bilder. Unsere Anlage verfügt über ein Sortiment von HFUS transducers wie beschrieben, so dass wir sie benutzt haben, um Bilder von höchster Qualität zu erhalten. Wenn die Wandler beschreiben wir die nicht verfügbar sind, ist es jedoch möglich, die Bilderzeugung unter Verwendung anderer Sensoren anzupassen. Zu diesem Zweck wird die Einstellung der Bildtiefe und Breite, um eine ausreichende Bild erhalten, ist alles, was erforderlich. Auflösung solcher Bilder kann variieren, es sollte jedoch immer noch möglich sein, Bilder hoher Qualität unter Verwendung HFUS erhalten. Abbildungs Sehenswürdigkeiten der Mundhöhle und der Schilddrüse werden große Hilfe bei der Ausrichtung des Benutzers an die richtige Bereich, wo die Lymphknoten lokalisiert. Die charakteristische ovale, echoarme Art und oberflächliche Lage in der Nähe der Hautoberfläche ermöglicht eine schnelle Identifizierung der Zweithalslymphknoten in der richtigen Halsbereich. Während alle drei Knoten können in einer einzigen Bildebene (3B) sichtbar werden, werden typischerweise eine oder zwei Knoten während der Bilderzeugung erfasst. Kleinere Anpassungen der Wandlerposition durchgeführt, um zu zerreißen werdener verschiedene Bildebenen sichtbar und ermöglicht die Visualisierung aller Knoten auf einer einzigen Seite des Halses.
Zwar haben wir die beschriebene Technik zuverlässig zum Identifizieren zervikalen Lymphknoten gefunden werden, gibt es bestimmte Beschränkungen für die Bildgebung und Biopsietechnik. Die oberflächliche Natur der Maus Halslymphknoten verleiht übermäßige Mobilität auch leichten Druck auf die Haut über den Wandlerkopf angewendet. Dies kann durch langsames Anlegen der Wandlerkopf in die Ultraschall-Gel auf der Maus Hals, bis die Wahrzeichen Bilder identifiziert werden entgegengewirkt werden. Lymphknoten Mobilität kann auch erschweren die Feinnadelbiopsie, insbesondere bei Verwendung von Sensoren in der höheren Auflösung (50 MHz) -Bereich. Zentriert Bilder von Lymphknoten für die Biopsie werden typischerweise aus dem Sichtfeld auf Grund der Kraft der Biopsienadel benötigt, um die darüber liegende Haut und die Kapsel zu durchstechen geschoben. Dies kann durch die außermittige Positionierung der Lymphknoten in Richtung der Nadeleinstich behoben werden kann,Nutzfläche die Lymphknoten, über geschoben werden, aber dennoch im Sichtfeld während der Biopsie. Nach unserer Erfahrung Lymphknoten> 10 mm 3 sind sehr schwierig zu Biopsie, und werden häufig durch die Nadel während der Nadelvorschub geschoben anstatt eingedrungen. So wird Biopsie am besten für vergrößerte Lymphknoten, wo die Größe ist reserviert> 10 mm 3, um eine ausreichende Knotenzielgröße und Stabilität im Halsbereich zu gewährleisten. Zusätzlich kann Biopsiematerial enthält ausreichende Zellzahlen für Verfahren, bei denen größere Zellzahlen benötigt werden (zB Durchflusszytometrie).
HFUS wurde genutzt, um erfolgreich zu visualisieren orthotopen HNSCC Tumoren 25 und hat das Potenzial, Halslymphknotenmetastasen in Mäusen, die mit oralen Tumoren 24 zu überwachen. Zusätzlich zu Ultraschall hat Biolumineszenz-Bildgebung auch verwendet worden, um oral orthotope Tumorbildung und zervikalen Lymphknoten-Metastasen in lebenden Mäusen 26,27 visualisieren. Als alterntive Ansatz hat Biolumineszenz-Bildgebung einen deutlichen Vorteil gegenüber HFUS in der Lage, direkt zu quantifizieren Tumorprogression und metastasierendem Belastung im Laufe der Zeit in dem gleichen Tier. Während zweifellos nützlich ist Biolumineszenz-Bildgebung nicht in der Lage, viele der Parameter durch HFUS visualisiert, einschließlich Lymphknoten Morphologie Knotenvolumen oder den Blutfluss zu messen. Biolumineszenz-Bildgebung erfordert auch spezialisierte dunklen Kästen an Mäuse während der Bildgebung zu halten, wodurch diese Technik für die Anpassung für Feinnadelbiopsie ungeeignet.
Weiterhin Biolumineszenz-Bildgebung erfordert die Herstellung von Tumorzellen, die stabil exprimieren das Luciferase-Enzym, so dass dieses Verfahren nur in den Fällen von orthotope Xenotransplantaten mit Luciferase-transfizierten Tumorzellen in immunsupprimierten Mäusen oder mit induzierbarer gewebsspezifische transgenen Systemen, die Luciferase-Expression verwendet werden, beschränken in einem räumlich-zeitlichen spezifische Weise an das Gewebe von Tumor Ursprungs. Im Gegensatz dazu kann HFUS U BEin Verbindung mit Biolumineszenz Bilder in diesen Modellen Sed, sowie in der Lage ist Abbilden Lymphknoten in Modellen der Karzinogen-induzierte oralen Tumoren in Mäusen mit vollständigen Immunsystem 28,29. Während HFUS kann mehr an die meisten Mausmodellen von Mundkrebs, der in Kombination gegenüber der Biolumineszenz und HFUS Bildgebung in Systemen erhalten werden können, in denen Tumorzellen exprimieren Luciferase kann ein vollständigeres Bild der zervikalen Lymphknotenbefall als die beiden bildgebenden Verfahren allein bieten.
Die Fähigkeit, in Echtzeit zu identifizieren und zu erfassen Maus Lymphknoten erlaubt diese Technik in den meisten Modellen von Erkrankungen der Mundhöhle, die in entzündlichen Lymphadenopathie, den das Tier in einer umgekehrten Position unter Kurznarkose aufrechterhalten werden Ergebnisses verwendet werden. Nachweis von Lymphknotenmetastasen oder bakterielle Infektion und der damit verbundenen Auswirkungen auf die Lymphknoten-Morphologie in lebenden Tieren stellt einen signifikanten Vorteil gegenüber traditionellen Methodenführen, die Lymphknoten, um von toten Tieren zur histologischen Verarbeitung entfernt werden. Kombinieren HFUS mit Feinnadelbiopsie erlaubt eine Einrichtung zum Leiten pathologische Routineanalyse des zervikalen Lymphknoten, ähnlich dem, was in der Klinik durchgeführt, ein verbessertes Verfahren zur Überwachung der Progression der Erkrankung in den meisten aktuellen Mausmodellen der Mundhöhle Erkrankungen.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Dorothy D. Radford Stiftungsfonds von der West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center unterstützt. Die Verwendung der West Virginia University Tiermodellen und Imaging Facility (AMIF) und Mikroskopie Imaging Facility (MIF) (von der Mary Babb Randolph Cancer Center und NIH Zuschüsse P20 RR16440 unterstützt, P30 RR032138 / GM103488 und S10 RR026378) gedankt.
Materials
| Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11945 | |
| Power Dopper Mode and 3D Mode | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11952; VS-11484 | |
| Vevo compact anesthesia system | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | ||
| Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | SA-11983 | |
| Thermasonic Gel Warmer | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | Optional | |
| Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz – 55 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11960 | Referred to as 40 MHz Transducer |
| Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz – 70 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-12026 | Referred to as 50 MHz Transducer |
| Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-1663 | |
| Electrode gel | Parker Laboratories | 174-1525 | |
| Tape | Medical Arts Press | 174-153000 | |
| Depilatory Cream | Carter Products | ||
| Cotton swabs | General Supply | ||
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-907 | |
| Water | General Supply | ||
| Lubricating gel | Parker Laboratories | 57-05 | |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories | 01-50 | |
| Microcentrifuge tube rack | General Supply | Used to raise mouse platform for optimal biopsy position | |
| 27G ½ inch needle with 1 ml syringe | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| ThinPrep PreservCyt Solution | Hologic | 70097-002 | Refered to as biopsy media |
| Microcentrifuge tubes | General Supply | ||
| Thinprep 2000 processor | Cytyc, Marlborough, MA | Blue Filter | |
| Olympus AX70 Provis Microscope | Olympus, Center Valley, PA |
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