Dit protocol beschrijft de toepassing van hoogfrequente ultrageluid (HFUS) voor imaging muizen cervicale lymfeknopen. Deze techniek optimaliseert visualisatie en kwantificatie van cervicale lymfeknopen morfologie, volume en de bloedstroom. Beeld-geleide biopsie van cervicale lymfeklieren en verwerking van lymfeweefsel voor histologische evaluatie wordt ook aangetoond.
High-frequency ultrasound (HFUS) wordt algemeen gebruikt als een niet-invasieve werkwijze voor het afbeelden van interne anatomische structuren bij experimentele dieren kleine systemen. HFUS heeft de mogelijkheid om structuren te detecteren van slechts 30 urn, een eigenschap die is gebruikt voor het visualiseren oppervlakkige lymfeklieren in knaagdieren helderheid (B) -mode. Combineert vermogen Doppler met B-modus beeldvorming maakt meten bloedsomloop bloedstroom in lymfeknopen en andere organen. Terwijl HFUS is gebruikt voor lymfeknoop beeldvorming in een aantal muis modelsystemen, heeft een gedetailleerd protocol beschrijft HFUS beeldvorming en karakterisatie van de cervicale lymfeknopen bij muizen niet gerapporteerd. Hier tonen we aan dat HFUS kunnen worden aangepast voor het detecteren en karakteriseren cervicale lymfeknopen bij muizen. Gecombineerde B-mode en power Doppler beeldvorming kan worden gebruikt om verhogingen in bloedstroming in immunologisch vergrote cervicale knooppunten detecteren. Wij het gebruik van B-modus beeldvorming te beschrijven ook fijne naald biopten van cervicale lymfe geen gedragdes te lymfeweefsel voor histologische analyse halen. Tenslotte worden-software geholpen stappen beschreven op veranderingen in lymfeklieren volume te berekenen en om veranderingen in de lymfeklieren morfologie volgende beeld reconstructie te visualiseren. Het vermogen om veranderingen in cervicale lymfeknopen biologie visueel controleren mettertijd een eenvoudige en krachtige techniek voor de niet-invasieve bewaking van halskliermetastasen veranderingen in preklinische muismodellen van mondholte ziekten.
Lymfedrainage van interstitiële weefselvocht is de belangrijkste methode van verspreiding van besmettelijke micro-organismen en kankers die ontstaan in de orale en maxillofaciale regio 1,2. Klinische evaluatie van cervicale lymfeknopen is een gangbare diagnostische praktijk toegepast om de aanwezigheid of progressie van aandoeningen die ontstaan in de mondholte te bepalen. Dit onderstreept het belang van het verzamelen cervicale lymfeknopen waardevolle anatomische plaatsen voor orale ziektediagnose 3. Verscheidene gespecialiseerde imaging methodes worden klinisch gebruikt voor het identificeren van zieke cervicale lymfeknopen. Deze omvatten positron emissie tomografie (PET), computertomografie (CT) en magnetische resonantie imaging (MR). Terwijl zeer waardevolle, deze werkwijzen vereisen alle uitgebreide patiënt bereiding, zeer gespecialiseerde apparatuur en / of chemische infusie in de circulatie te activeren of te versterken het belichtingsproces.
Echografische beeldvorming (echografie, VS) is een algemeen toegepaste techniek die gebruikt wordt om imleeftijd cervicale lymfeklieren presenteren met lymfadenopathie als gevolg van infectie of gemetastaseerde betrokkenheid 4-6. US wordt vaak gecombineerd met PET-CT en MR aan een uitgebreide weergave van de patiënt lymfeklierstatus verschaffen, waardoor stagering en noodzaak bepalen voor chirurgische excisie 7. De niet-invasieve karakter van US ook inherente voordelen boven andere beeldvormingsmodaliteiten, waaronder gebruiksgemak, lage kosten, minimaal ongemak voor de patiënt en voorbereiding. De oppervlakkige subcutane locatie van de meeste cervicale lymfeklieren laat voor ons om minimaal invasieve fijne naald aspiratie biopsieën begeleiden met grotere precisie, het verbeteren van diagnostische nauwkeurigheid 8.
Commerciële hoge frequentie (HF) US biedt gedetailleerde resolutie van interne anatomische structuren tot 30 pm 9. Met transducers gaande 22-70 MHz is HFUS is gemakkelijk toegepast op een verscheidenheid van experimentele knaagdier systemen om real-time beeldvorming van organen in vivo mogelijk.; HFUS is aangepast voor visualisatie van tumorvorming in gebruikelijke helderheid (B) -mode, alsook met een aantal algemene en specifieke contrastverbetering agents9. Met behulp van de macht Doppler met HFUS biedt de mogelijkheid om te controleren bloedstroom binnen muis tumoren, waardoor een uitgebreide beoordeling van angiogene perfusie in levende muizen 10,11. HFUS is gebruikt om zieke muizen lymfeklieren visualiseren in het hoofdlichaam holte, waaruit parallel nut van deze technologie voor de klinische praktijk. In het bijzonder ontstekings- en metastatische lymfeknoop viscerale veranderingen waargenomen in muismodellen van kanker borstkanker herbergen 12,13, pancreas 14, colorectal 15 en longen 16 tumoren, alsmede vezelachtige histocytomas 17 en een oude muismodel van verworven hydronephrosis 18 . Deze voorbeelden stollen de waarde van HFUS als krachtig onderzoeksinstrument voor tumor geïnduceerde lymfadenopathie in diverse rodeuk systemen.
Verschillende modellen van bacteriële infecties 19,20 en hoofd en nek geschubde cel carcinoom (HNSCC) 21,22 ontwikkeld om deze ziekten te bestuderen in de preklinische setting. In tegenstelling tot de mens, muizen bevatten drie cervicale lymfeklieren die lymfe enquête van mondholte weefsels (onderkaak, submandibulaire onderkaak en oppervlakkige parotis 23). Recent rapporteerden we het gebruik van HFUS de locatie en morfologie van deze lymfeknopen kaart, het beoordelen van wijzigingen lymfklier volume en de bloedstroom in een carcinogeen-geïnduceerde muismodel van HNSCC 24. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van HFUS voor het identificeren, beeldvorming en analyse cervicale lymfeknopen in levende muizen. Dit protocol toont ook de haalbaarheid van het gebruik HFUS om beeld- geleide fijne naald biopsie van vergrote muis cervicale lymfeklieren te voeren, waardoor histologische monitoring van veranderingen in de cervicale lymfeklieren inhoud en pathologieën dan tijd in hetzelfde dier. Dit protocol gemakkelijk kan worden aangepast om de gedetailleerde studie van cervicale lymfeknopen pathologieën verkregen vanuit invasieve mondholte ziekte in muizen.
De beschreven protocol zorgt voor de visualisatie en in situ evaluatie van murine cervicale lymfeknopen met behulp van niet-invasieve beeldvorming HFUS. Het gebruik van B-mode en power Doppler imaging visualiseren halskliermetastasen morfologie, volume en lymfeknoop bloedtoevoer voorziet in een experimentele analyse van preklinisch muis modelsystemen vergelijkbaar met die toegepast voor het karakteriseren van de patiënt cervicale knooppunten in de klinische praktijk. De mogelijkheid om de cervial lymfeknopen via fijne naald biopsie monitoren verschaft ook een geschikte techniek voor het detecteren immuuncel wijzigingen en de aanwezigheid van vreemde celtypen of bacteriën tijdens mondholte ziekte geïnduceerde Lymfadenopathieën in muizen. Het gebruiksgemak en lage kosten verbonden aan HFUS zorgt de snelle screening van cervicale lymfeknoopstatus in diverse diermodellen.
Een kritische stap in dit protocol de eerste succesvolle identificatie van de cervicale lymfeknopen in HFUS afbeeldingen. Onze faciliteit heeft een assortiment van HFUS transducers zoals beschreven, zodat we ze hebben gebruikt om de hoogste kwaliteit beelden te verkrijgen. Indien de transducers beschrijven we niet beschikbaar zijn, is het mogelijk de beeldvorming op andere transducers passen. Daartoe aanpassing beelddiepte en breedte voldoende resultaat krijgt is alles wat nodig is. Resolutie van dergelijke beelden kan variëren, maar het moet toch mogelijk zijn om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen door het gebruik van HFUS. Imaging oriëntatiepunten van de mondholte en de schildklier sterk zal helpen bij het oriënteren van de gebruiker de juiste regio waar de lymfeklieren gelokaliseerd. De karakteristieke ovale, hypoechoic natuur en oppervlakkige ligging dicht bij het huidoppervlak zorgt voor een snelle bevestiging van de identificatie van de cervicale lymfeklieren in de juiste halsgebied. Hoewel alle drie knooppunten zichtbaar in een beeldvlak (figuur 3B) kunnen zijn, kenmerkend één of twee knooppunten gevangen tijdens beeldvorming. Kleine aanpassingen van de transducer positie kan worden uitgevoerd om te scheurener verschillende beeldvlakken toegankelijk, waardoor visualisatie van alle knooppunten op één zijde van de nek.
Terwijl we de beschreven techniek voor het identificeren betrouwbare cervicale lymfeknopen zijn gevonden, zijn er specifieke beperkingen voor de beeldvorming en biopsie techniek. De oppervlakkige aard van de muis cervicale lymfeknopen verleent overmatige mobiliteit die zelfs lichte druk wordt aangebracht op de huid via de transducer weg. Dit kan worden tegengegaan door langzaam toepassing van transductorkop in de ultrasone gel op de muis hals tot de landmark beelden worden geïdentificeerd. Lymfeklier mobiliteit kan ook compliceren de fijne naald biopsie, vooral bij gebruik van transducers in de hogere resolutie (50 MHz) bereik. Gecentreerde afbeeldingen lymfeklieren biopsie worden meestal uit het gezichtsveld geduwd als gevolg van de kracht van de biopsienaald die nodig is om de bovenliggende huid en capsule punctie. Dit kan worden verholpen door de excentrische plaatsing van de lymfeklieren in de richting van de naald binnenkomst,verschaffen van ruimte voor de lymfeklieren over worden geschoven maar nog steeds binnen het zichtsveld blijven gedurende biopsie. In onze ervaring, lymfeknopen> 10 mm 3 zeer moeilijk biopsie en vaak geduwd door de naald gepenetreerd in plaats van de naald vooruit. Zo wordt biopsie best gereserveerd voor vergrote lymfeklieren, waar de grootte is> 10 mm 3 om voldoende knooppunt beoogde omvang en stabiliteit binnen de cervicale regio. Bovendien kan biopsie materiaal onvoldoende aantallen cellen bevatten in procedures waarbij grote aantallen cellen zijn (bv flowcytometrie).
HFUS is gebruikt om succesvol visualiseren orthotope HNSCC tumoren 25, en heeft het potentieel om cervicale metastase in muizen met orale tumoren 24 volgen. Naast ultrageluid is bioluminescentiebeeldvorming ook gebruikt om orthotope orale tumorvorming en cervicale lymfekliermetastasen visualiseren in levende muizen 26,27. Als een alterntieve benadering, bioluminescentie beeldvorming heeft een duidelijk voordeel ten opzichte HFUS in staat om direct te kwantificeren progressie van de tumor en metastatische last over de tijd in hetzelfde dier. Terwijl onmiskenbaar nuttig, bioluminescentie beeldvorming kan niet veel van de parameters gevisualiseerd door HFUS, waaronder lymfeknoop morfologie of knooppunt volumes of bloed te meten. Bioluminescentie beeldvorming vereist ook gespecialiseerde donkere dozen om muizen te behouden tijdens de beeldvorming, waardoor deze techniek niet geschikt voor aanpassing voor fijne naald biopsie.
Bovendien bioluminescentie beeldvorming vereist productie van tumorcellen die stabiel tot expressie het luciferase-enzym, waardoor deze techniek alleen gebruikt in geval van orthotope xenotransplantaten met luciferase-getransfecteerde tumorcellen in immuungecompromitteerde muizen, of induceerbare weefselspecifieke transgene systemen die luciferase-expressie beperken in een ruimte-tijd manier die specifiek zijn voor het weefsel van de tumor oorsprong. In tegenstelling, kan HFUS u zijnsed in samenhang met bioluminescentie afbeeldingen in deze modellen, maar ook in staat beeldvorming cervicale lymfeknopen in modellen van carcinogeen-geïnduceerde orale tumoren bij muizen met volledige immuunsysteem 28,29. Terwijl HFUS kunnen meer aan te passen aan de meeste muismodellen van mondkanker, de gecombineerde informatie die kan worden verkregen van bioluminescentie en HFUS beeldvorming in systemen waarbij tumorcellen drukken luciferase kan een completer beeld van cervicale lymfeklieren betrokkenheid dan beide beeldvormingsmodaliteit alleen bieden.
Het vermogen om muizen cervicale lymfeknopen in real time geïdentificeerd en maakt deze techniek wordt gebruikt in de meeste modellen van orale ziekten die resulteren in inflammatoire lymfadenopathie waar het dier in een omgekeerde stand onder kortdurende anesthesie te handhaven. Detectie van lymfeknoop metastase of bacteriële infectie en de daarmee gepaard gaande gevolgen lymfeklier morfologie in levende dieren biedt een significant voordeel ten opzichte van traditionele methodendie vereisen lymfeklieren van dode dieren voor histologische verwerking worden verwijderd. De combinatie HFUS met fijne naald biopsie kan een middel voor het uitvoeren van routinematige pathologische analyse van cervicale lymfeknopen, vergelijkbaar met wat wordt uitgevoerd in de kliniek, een verbeterde werkwijze voor het bewaken van progressie van de ziekte in de meeste huidige muizenmodellen van mondholte ziekten.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door Dorothy D. Radford Endowment fonds van de Universiteit van West Virginia Mary Babb Randolph Cancer Center. Het gebruik van de West Virginia University diermodellen en Imaging Facility (AMIF) en Microscopie Imaging Facility (MIF) (ondersteund door de Mary Babb Randolph Cancer Center en NIH subsidies RR16440 P20, P30 RR032138 / GM103488 en S10 RR026378) is dankbaar erkend.
Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11945 | |
Power Dopper Mode and 3D Mode | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11952; VS-11484 | |
Vevo compact anesthesia system | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | ||
Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | SA-11983 | |
Thermasonic Gel Warmer | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | Optional | |
Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz – 55 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11960 | Referred to as 40 MHz Transducer |
Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz – 70 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-12026 | Referred to as 50 MHz Transducer |
Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-1663 | |
Electrode gel | Parker Laboratories | 174-1525 | |
Tape | Medical Arts Press | 174-153000 | |
Depilatory Cream | Carter Products | ||
Cotton swabs | General Supply | ||
Gauze | Fisher Scientific | 22-037-907 | |
Water | General Supply | ||
Lubricating gel | Parker Laboratories | 57-05 | |
Ultrasound gel | Parker Laboratories | 01-50 | |
Microcentrifuge tube rack | General Supply | Used to raise mouse platform for optimal biopsy position | |
27G ½ inch needle with 1 ml syringe | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
ThinPrep PreservCyt Solution | Hologic | 70097-002 | Refered to as biopsy media |
Microcentrifuge tubes | General Supply | ||
Thinprep 2000 processor | Cytyc, Marlborough, MA | Blue Filter | |
Olympus AX70 Provis Microscope | Olympus, Center Valley, PA |