Misurazione della massima isometrica forza generata dal permeabilizzate scheletrici fibre muscolari

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali o umani dovrebbero essere effettuate in conformità alle linee guida, regolamenti, e le agenzie di regolamentazione. L'Università del Michigan Comitato per l'uso e la cura degli animali (UCUCA) e l'Università del Michigan Medical Center Institutional Review Board ha approvato tutte le procedure umane descritte in questo articolo e animali. 1. Fare dissezione e di memoria Stock Solution Nota: I volumi finali specificate nei seguenti istruzioni possono essere scalati verso l'alto o verso il basso, se lo desideri. In un becher da 1000 ml aggiungere 800 ml di acqua deionizzata (ASTM Tipo 1). Il mantenimento di un scalpore dolce, aggiungere tutti i composti elencati nella tabella 1 per l'acqua deionizzata e permettere loro di sciogliere. Composto Desiderato Conc. (M) Formula Peso (g / mol) Aggiungere a 1 L (g) </ Tr> K-propionato 0.250 112.17 28,040 Imidazolo 0.040 68.08 2.720 EGTA 0,010 380,40 3.800 MgCl 2 • 6H 2 O 0.004 203,31 0.813 Tabella 1: dissezione e magazzino soluzione di storage componenti. Portare a un volume finale di 1000 ml con acqua deionizzata. Si noti che non è necessario pH della soluzione in questo momento. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C. 2. Fare soluzione di storage Per fare 200 ml di soluzione di archiviazione, iniziare con 100 ml di dissezione e soluzione di storage magazzino in un bicchiere da 250 ml. Aggiungere sufficiente Na 2 H 2 ATP per portare adenosina finaletrifosfato (ATP) concentrazione di 2 mM. Portare a un volume finale di 200 ml con glicerolo. Regolare a pH 7,00 con idrossido di potassio (KOH). Conservare la soluzione di storage a -20 ° C. Nota: A causa della natura viscosa di glicerolo può essere difficile per erogare con precisione in volume. A causa di questo, di solito aggiunge glicerolo in peso (100 ml di glicerolo pesa circa 126 g). 3. Fare dissezione Solution Per fare 200 ml di soluzione di dissezione, iniziare con 100 ml di soluzione madre dissezione e stoccaggio in un becher da 250 ml. Aggiungere sufficiente Na 2 H 2 ATP per portare concentrazione finale di ATP a 2 mM. Regolare il pH a 7,00 con KOH. Portare il volume finale a 200 ml con acqua deionizzata. Aliquota dei volumi di 2,5 ml e conservare a -80 ° C. 4. Fai dissezione Soluzione con Brij 58 Nota: Brij 58 è un detergente non ionico che sconvolge (permeabilizes) doppi strati lipidici. <ol> Per fare 200 ml di soluzione di dissezione con Brij 58, iniziare con 200 ml della soluzione di dissezione in un becher da 250 ml. Il mantenimento di un scalpore dolce, aggiungere 1 g di Brij 58 (0,5% w / v) alla soluzione dissezione e farlo sciogliere. Aliquota dei volumi di 2,5 ml e conservare a -80 ° C. 5. Fare Soluzioni per prove Nota: La seguente è adattato da Moisescu e Thieleczek 1978 (6). Si veda la discussione per ulteriori commenti sulla preparazione di soluzioni di test. Preparare tre distinte 1.000 ml bicchieri etichettati "Rilassante", "Pre-attivazione" e "Attivazione". Aggiungere 400 ml di acqua deionizzata in ogni beaker. Aggiungere i composti indicati nella tabella 2 nel becher appropriato e quindi riscaldare la soluzione a tra 70 ° C e 80 ° C. Mantenere una temperatura della soluzione di 70-80 ° C per 30 min agitando continuamente. Nota: una temperatura di 70-80 ° C favorisce la eliminazione dell'acido carbonico formato dalla reazione di carbonato di calcio con EGTA nella soluzione attivante. Le rilassanti soluzione soluzioni e pre-attivazione vengono trattati nello stesso modo come la soluzione attivante per mantenere la coerenza. SOLUZIONE RILASSANTE PRE-ATTIVAZIONE SOLUZIONE ATTIVAZIONE SOLUZIONE Composto Formula Peso (g / mol) Concentrazione desiderata (mm) Richiesto Massa (g) Concentrazione desiderata (mm) Richiesto Massa (g) Concentrazione desiderata (mm) Richiesto Massa (g) HEPES (acido) 238,30 90.0 10,724 90.0 10,724 90.00 10,724 MgO 40.31 10.3 0,208 8.5 0,171 8.12 0,164 EGTA (acido) 380,40 52.0 9,890 52.00 9,890 HDTA (acido) 348,36 50.0 8,709 CaCO3 100.10 50.00 2.503 Tabella 2: Relaxing, pre-attivazione e attivazione componenti della soluzione. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e aggiungere sufficiente NaN 3 / KOH per portare la concentrazione finale NaN 3 a 1 ​​mM. ATTENZIONE: NaN 3 (sodio azide) è velenoso. Consultare la scheda di sicurezza chimica prima di maneggiare questa sostanza chimica. Per fare 100 ml di 100 mM di soluzione di sodio azide, aggiungere 0,65 g di NaN 3 a 10 ml di 1 N KOH. Regolare ad un volume finale di 100 ml con acqua deionizzata. Regolare il pH a circa 7.10 con KOH. Seguendo passo 5.4 aggiungere sufficiente Na 2 H 2 ATP per portare la concentrazione finale di ATP a 8 mM e sufficiente Na 2 CrP per portare la creatina phosophate finale (CRP) concentrazione di 10 mM. Portare ogni soluzione al volume finale di 500 ml con acqua deionizzata. Freddo o riscaldare le soluzioni alla temperatura alla quale saranno eseguiti esperimenti, quindi utilizzare KOH per portareil pH a 7,10 mantenendo tale temperatura. Aggiungere la soluzione nel becher contenente la soluzione pre-attivazione relax tale che questa soluzione pre-attivazione è di 1 parte di soluzione in 500 soluzione pre-attivazione rilassante. Aliquota dei volumi di 2,5 ml e conservare a -80 ° C. 6. Fare sutura Loops Inizia con un filo di non sterile USP 10-0 monofilamento di nylon di sutura. Utilizzare le pinze per creare un ciclo con il filo con la tecnica della doppia nodo semplice. Ridurre il nodo per dimensioni, a circa 750 micron di diametro. Diametro Loop può essere valutata al microscopio con marcature oculare reticolo. Utilizzare microdissecting forbici per eliminare l'eccesso di sutura lasciando solo il ciclo e piccolo (500 micron) code su entrambi i lati. Un esempio di un ciclo finito è mostrato in Figura 1. Ripetere i passaggi sono stati fatti 6,2-6,3 fino a 4 cicli utilizzabili. Conservare loop in un silicone placcato elastomero petri piatto per uso futuro. Nota: quattro cicli di sutura sono necessari per ogni fibra testato. 7. Bundle campione Nota: Le seguenti operazioni descrivono la procedura per sezionare il campione originale in piccole "fasci" sperimentale da cui saranno eventualmente estratti e testati singole fibre. In ogni momento il campione deve essere trattato con cura. Ai fini della presente descrizione, le istruzioni saranno dati come se il ricercatore è di mano destra. Ottenere il campione di interesse e trasferirlo nella struttura dove dissezione avrà luogo. Nota: I metodi di biopsia dei tessuti variano a seconda del modello sperimentale e disegno dello studio. Ove possibile, perfusione muscolare dovrebbe essere mantenuta fino al momento della biopsia. Se il campione deve essere trasferita tra il sito di raccolta e il sito dissezione, trasportarlo in una fiala contenente soluzione dissezione refrigerate mentre mantenuto in ghiaccio. Preparare una capsula di Petri 5 centimetri elastomero siliconico placcato con soluzione di dissezione raffreddato e 2-3 perni di montaggio insetti (100 micron di diametro, in acciaio inox). Trasferire il campione al piatto. Assicurarsi che il campione rimanga sommersa con l'aggiunta di più soluzione di dissezione, se necessario. Controllare il campione al microscopio e manipolarlo per allineare gli assi longitudinali delle fibre verso la spalla destra del ricercatore (Figura 2). Poi ancorare il campione al piatto appuntando agli angoli. Nota: Fare uso di qualsiasi tessuto connettivo rimanente come punti di ancoraggio in questo momento dato che questo ci permetterà di ottimizzare l'uso del campione e conservare l'integrità della fibra. Il bundle può essere bloccato in lieve tensione per contribuire a definire margini tra fibra. Con la pinza nella mano sinistra e le forbici microdissecting nella destra, iniziare sezionare delicatamente un fascio lungo i margini longitudinali tra le fibre Nota: A seconda della sualunghezza fuori tutto, sezionare ulteriormente il fascio in numerosi fasci più piccoli. Assicurarsi che le dimensioni del pacco misurano circa 0,5-1 mm di larghezza e ≥3 mm di lunghezza. Valutare le dimensioni utilizzando un microscopio con le marcature del reticolo nell'oculare, o mettendo un righello sotto il piatto. Rimuovere e scartare qualsiasi tessuto che viene danneggiato dalle pinze o perni a seguito del processo di dissezione. Ripetere il processo fino a quando un numero sufficiente di fasci sono stati sezionati o fino a quando il campione è stato esaurito. Nota: Il numero di fasci ottenibili dipendono da numerosi fattori tra cui la dimensione e la condizione del campione iniziale, la morfologia del muscolo, e l'abilità del ricercatore. 8. Fibre permeabilize Trasferire i fasci dalla soluzione dissezione in un flaconcino contenente 2,5 ml di acqua refrigerata, soluzione fresca, sezionando con il detergente non ionico 'Brij 58' aggiunto(0,5%, w / v). Incubare in ghiaccio per 30 minuti, con occasionale, agitazione. Assicurarsi che i fasci rimangano sommerse durante l'incubazione. Alla fine dei 30 minuti di incubazione, trasferire i fasci per una fiala contenente la soluzione dissezione fresco (senza Brij 58) e agitare delicatamente e brevemente per rimuovere eventuali residui di detersivo. 9. Preparare Bundles per l'archiviazione Trasferire i fasci per una fiala contenente la soluzione di stoccaggio refrigerata e incubare una notte a 4 ° C. 10. Conservare Bundles Il giorno seguente, preparare una scatola di immagazzinaggio, in grado di sopportare -80 ° C, con un numero sufficiente singole da 0,5 ml a vite tubi conici tappo per accogliere tutti i bundle ottenuti durante il processo di dissezione (un fascio per provetta). Ogni tubo conico deve essere riempito con 200-400 ml di soluzione di storage fresco. Trasferire i fasci nei tubi coniche etichettate singolarmente. Assicurarsi che il pacchetto non è bloccato ail lato del tubo conico o galleggianti sulla superficie della soluzione. Tappare le provette coniche e conservare i campioni a -80 ° C fino al giorno del test. 11. Preparare apparato sperimentale Nota: L'apparecchio personalizzato è composto da una fase che ospita un regolatore di lunghezza e trasduttore di forza, un sistema di camera di movimento e un microscopio dissezione 10X. Impianti di trasmissione Micrometro consentono la manipolazione precisa delle superfici di fissaggio in fibra. Figure di diffrazione laser sono utilizzati per stimare la lunghezza sarcomero. I dati generati durante la sperimentazione sono registrati su un personal computer. Fare riferimento alla Figura 3 per le immagini con annotazioni del set-up sperimentale. Scongelare una fiala ciascuna delle soluzioni attivando rilassante, pre-attivazione e e mantenere in ghiaccio. Si noti che l'ATP e CrP sono composti labili che dovrebbero essere mantenuti a temperature fredde. Preparare il microscopio, apparecchiatura di prova e il computer associato all'uso. </li> Riempire la prima camera sperimentale con una soluzione rilassante. Nel nostro apparato, la prima camera contiene prismi che permettono al ricercatore di fotografare la fibra dal lato. Riempire la seconda camera sperimentale con una soluzione pre-attivazione e la terza con l'attivazione di una soluzione. Regolare la temperatura in modo che il display termometro in-camera di lettura 15 ° C. Discussione due anelli di sutura preparate sulle superfici di fissaggio in acciaio inossidabile che si estendono sia dalla forza trasduttore e lunghezza controller (Figura 5A). 12. Estratto permeabilizzate fibra singola Scongelare un fascio di fibre di interesse, e il trasferimento di una capsula di Petri elastomero siliconico placcato con fresco, soluzione rilassante refrigerati. Fissare il bundle con perni alle due estremità e assicurarsi che sia sommersa. Utilizzando le pinze, afferrare una fibra ad una estremità e cominciare uniformemente estraendolo lungo il suo asse longitudinale. Nota: i danni alla compressione alall'estremità della fibra causato dalle pinze non è una preoccupazione in questo momento dato che non saranno testati le proprietà contrattili in questa zona. Si deve, tuttavia, essere presa quando si estraggono fibre dal fascio dal aderenze tra le fibre e la matrice extracellulare può causare eccessiva tensione, portando in definitiva danni per allungare-indotta. Si noti che esiste una notevole variabilità tra muscoli nella misura in cui le fibre aderiscono alla matrice extracellulare circostante. Fibre che si sospetta siano stati danneggiati da tale tratto devono essere eliminati. Utilizzare una lama di rasoio o bisturi per modificare un puntale come mostrato nella (Figura 4). Introdurre la fibra nella punta con una piccola quantità di soluzione rilassante. Trasferire la singola fibra dal Petri elastomero siliconico placcato alla camera sperimentale che contiene la soluzione rilassante. 13. Monte Fibra singola Nota: A depicti step-by-stepsu possono essere visualizzati nella figura 5. Guida leggermente con le pinzette, rimuovere la fibra dalla punta della pipetta e ancorarlo al regolatore di lunghezza (a sinistra) con il primo ciclo di sutura. Utilizzare un unico movimento fluido quando stringendo il cappio con le pinze. Assicurarsi che una tensione uguale e contraria viene applicato alle estremità della sutura. Il primo ciclo deve essere legato circa 1 mm a 2 mm dall'estremità della superficie di fissaggio lunghezza controller. Manipolare l'altra estremità della fibra verso il trasduttore di forza (a destra) e fissare la fibra utilizzando la stessa procedura. Rimuovere l'eccesso di sutura con le forbici microdissecting (Figura 5C). Posizionare la fibra in una piccola quantità di tensione, aumentando la distanza tra la lunghezza-controllore e forza il trasduttore braccia con l'ascissa azionamento micrometro (Figura 3A). Infilare il secondo anello sopra il primo e ancorare la fibrain un punto entro 0,2 mm della fine della superficie di fissaggio forza-trasduttore (Figura 5D). Rimuovere l'eccesso di sutura con le forbici microdissecting. Il processo di attaccamento fibra può causare la perdita di soluzione dalla camera. Se necessario, aggiungere la soluzione più rilassante per garantire la superficie della soluzione è piatta (né concava nè convesso). Una superficie piana è importante nella valutazione lunghezza sarcomero utilizzando diffrazione laser. Allineare la fibra parallela alle pareti laterali della camera sperimentale regolando la posizione del regolatore di lunghezza in direzione y. Rilevare la fibra utilizzando la vista laterale del prisma e regolare la posizione della lunghezza controller in direzione dell'asse Z fino alla fibra è parallelo al pavimento della camera. Nota: Posizionamento della fibra parallela al pavimento della camera può essere realizzato senza prismi camera concentrandosi prima su un'estremità della fibra e tgallina, senza regolare la messa a fuoco del microscopio, portando l'altra estremità della fibra a fuoco usando la sua unità micrometro asse z. Se la fibra è in alcun modo contorto, attorcigliato o danneggiato come risultato del processo di montaggio, la fibra deve essere eliminata ed una nuova fibra collegato. 14. Imposta ottimale sarcomere Lunghezza Quando la fibra è stata allineata correttamente all'interno della camera, inserire la schermata di destinazione calibrato sulla faccia anteriore del microscopio e allinearlo sulla prima camera sperimentale. Nota: La schermata di destinazione viene calibrato utilizzando l'equazione reticolo standard λ = SL sinθ, dove SL è lunghezza sarcomero, θ è l'angolo di diffrazione tra 0 ° e 1 ° fasci diffratti e λ è la lunghezza d'onda del laser. Accendere il laser e regolare la posizione della fase tale che il laser passa attraverso il centro della fibra. ATTENZIONE: Concentrato luce laser può essere dannoso to la vista. Non tentare di visualizzare la fibra attraverso il microscopio quando il laser è acceso. Posizionare la fibra rispetto al fascio laser per diffrangere la luce laser ed osservare un patter interferenza sullo schermo di destinazione calibrato (Figura 6). Spegnere le luci per visualizzare questo modello in modo più chiaro. Nota: Se, con il corretto posizionamento del fascio laser, nessun modello di interferenza è visto, questo suggerisce che i componenti miofibrillari della fibra sono alterata / danneggiata e che la fibra deve essere sostituito con uno nuovo. Per impostare la lunghezza sarcomero, aumentare o diminuire la tensione sulla fibra utilizzando la lunghezza-controllore dell'unità micrometro ascisse fino alla spaziatura desiderata della luce diffratta è osservata sullo schermo di destinazione. Nota: La lunghezza sarcomero ottimale della fibra dipende dalla specie di animale da cui è stato ottenuto il campione. Una lunghezza sarcomero di 2,7 micron è comunemente assunto come ottimale quando asinicantare fibre da 7,8 tessuti umani. Dopo lunghezza ottimale sarcomero è stata impostata, misurare la distanza tra i due punti di sutura più interne. Questo è più facilmente ottenibile utilizzando il display digitale sull'unità micrometrica che controlla il movimento x-asse della camera. Posizionare la camera in modo tale che il reticolo verticale dell'oculare è allineato al confine più interna della sutura più interno e azzerare la lettura digitale sull'unità micrometro. Tradurre la fase lungo l'asse x rispetto al microscopio fino a raggiungere l'altra più interna suture. Il display digitale indicherà la lunghezza della fibra. Questo valore deve essere registrato come lunghezza delle fibre, L f. Nota: Si deve comprendere che la distanza tra i due punti di sutura più interni determina la lunghezza funzionale del tessuto contrattile in corso di valutazione. L'investigatore dovrebbe sforzarsi per la coerenza in questa dimensione (cioè L f) all'interno di unserie di esperimenti. 15. Stima trasversale Area (CSA) Mantenere la fibra a L f e utilizzare la fotocamera montata microscopio per acquisire un'immagine alto ingrandimento della porzione centrale della fibra sia dalla parte superiore e laterale. Immagini vista laterale possono essere acquisite utilizzando il prisma incorporato nel lato della camera. Nota: Quando si passa fra la parte superiore e laterale è importante per spostare il microscopio solo nella direzione y per garantire che le due immagini sono "a registro" e quindi mostrano due viste diverse della stessa sezione della fibra. Ottenere misurazioni in questo momento di normalizzare forza assoluta successivamente nello studio. Le tecniche per l'ottenimento di tali misurazioni sono descritti più avanti e illustrati nelle figure 7A e 7B. 16. Elicit isometrica Contrazione Nota: Mentre i dati generati nel corso di questi esperimentis possono essere raccolte e interpretati senza l'uso di un computer, un software che consente l'acquisizione, visualizzazione, memorizzazione e analisi delle risposte di forza è vantaggiosa. Il software LabVIEW personalizzato creato da nostro laboratorio consente queste funzioni, nonché la capacità di design 'treni Motion' che governano l'azione del regolatore di lunghezza durante un esperimento. Verificare che la temperatura del relax, pre-attivazione e soluzioni attivatori sono stabili a 15 ° C. Utilizzare il software di controllo della camera di spostare la fibra alla camera contenente la soluzione pre-attivazione e incubare per 3 min. Nota: La soluzione pre-attivazione è debolmente spone di Ca 2+, con conseguente attivazione e forza molto rapido sviluppo sulla introduzione della fibra alla soluzione attivante. Con 10 sec rimanente nella soluzione pre-attivazione e la lunghezza della fibra mantenuta a L f, stabilire uno zero folivello rce nel record sperimentale. Nota: Il movimento 'Trova forza zero' del-regolatore lunghezza rivela il livello di forza-trasduttore che corrisponde alla forza zero (cioè la fibra diventa brevemente allentamento a seguito del movimento). La forza passiva è la differenza tra lo zero e il livello di forza appena prima del movimento-trasduttore azzeramento. Alla fine del 3 min, spostare la fibra alla camera contenente la soluzione attivante e consentire massima forza isometrica per sviluppare come evidenziato da un plateau vigente che è preceduta da un rapido aumento. Dopo aver raggiunto la massima forza isometrica, utilizzare il controller di lunghezza per identificare la forza prodotta trasduttore che corrisponde alla forza zero nella camera contenente la soluzione attivante. Nota: Ciò è necessario perché la forza prodotta trasduttore che corrisponde alla forza zero è, in generale, diverso per ogni camera di soluzione-riempita. Dopo il raggiungimento di una seconda forza plateau, restituire la fibra alla camera contenente la soluzione rilassante. Il test è ora completa. Per provare più fibre durante qualsiasi aspirare una sessione tutte le soluzioni e aggiungere nuove soluzioni refrigerate. Nota: i protocolli di ciclismo del Brennero dovrebbero essere considerati quando suscitare contrazioni massimali per un periodo di tempo prolungato. Questo protocollo è stato dimostrato per conservare le proprietà strutturali e meccaniche della fibra massimo attivato 9.