Un poco costoso, test comportamentale scalabile per la misurazione etanolo sedazione sensibilità e tolleranza Rapid in<em> Drosophila</em
Özet
Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.
Abstract
L'uso di alcol disturbo (AUD) è una sfida di salute gravi. Nonostante una grande componente ereditaria per AUD, pochi geni sono stati inequivocabilmente implicati nella loro eziologia. Il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è un modello potente per esplorare i meccanismi molecolari alla base genetica comportamenti alcol-correlati e detiene quindi una grande promessa per l'identificazione e la comprensione della funzione dei geni che influenzano AUD. L'uso del modello Drosophila per questi tipi di studi dipende dalla disponibilità di saggi che misurano affidabile risposte comportamentali a etanolo. Questo rapporto descrive un test adatto per valutare la sensibilità etanolo e tolleranza rapida in mosche. Etanolo sensibilità misurata in questo saggio è influenzata dal volume e la concentrazione di etanolo utilizzato, una varietà di manipolazioni genetiche precedentemente riportati, e anche la lunghezza di tempo in linea sono alloggiati senza cibo immediatamente prima del test. Al contrario, etanolo sensitivity misurata in questo dosaggio non è influenzato dal vigore di movimentazione mosca, sesso in linea, e la supplementazione di mezzo di crescita con antibiotici o lieviti vivi. Tre metodi diversi per quantificazione sensibilità etanolo sono descritte, tutto conduce a risultati sostanzialmente indistinguibili sensibilità etanolo. La natura scalabile di questo test, in combinazione con la sua semplicità complessiva di set-up e relativamente a basso costo, lo rendono adatto per l'analisi piccola e grande scala genetica della sensibilità etanolo e tolleranza rapida in Drosophila.
Introduction
L'uso di alcol disturbo (AUD) è un problema di salute enorme in tutto il mondo (rivisto in 1). Sebbene i meccanismi di guida lo sviluppo di AUD sono complesse, questi disturbi hanno una notevole componente genetica (ad esempio, 2). La grande ereditabilità di AUD e le risposte comportamentali conservati in etanolo in molte specie (recensito in 3,4) hanno generato un forte interesse ad utilizzare organismi modello genetici per studiare il coinvolgimento di specifici geni nei comportamenti etanolo legate verso una migliore comprensione delle basi molecolari di AUD. Il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è emerso come organismo modello principale per esplorare i meccanismi molecolari-genetica dei comportamenti etanolo correlati (recensito in 3,4). Studi in mosche hanno evidenziato i ruoli per diverse vie di segnalazione nelle risposte comportamentali a etanolo (recensito in 5). Curiosamente, alcuni dei geni e dei percorsi che influenzare respons comportamentalies a etanolo in linea sono stati implicati in roditori comportamenti etanolo correlati e / o AUD umana (ad esempio, 6-14). La conservazione di meccanismi di guida comportamenti etanolo legate tra le specie, insieme con la suite di strumenti genetici disponibili nel sistema modello Drosophila, sottolineano l'utilità del modello di mosca della frutta per studiare la genetica di risposte comportamentali a etanolo.
Sensibilità 15,16 e tolleranza (rivisto in 17) di etanolo negli esseri umani è legato allo sviluppo di AUD. Entrambe queste risposte comportamentali a etanolo può essere modellato in linea attraverso una serie di test di laboratorio (rivisto in 3,4). Tutti i saggi mosca noti gli autori sono basati su uno dipendente dal tempo etanolo-indotta sedazione / incoordinazione o di recupero in funzione del tempo da etanolo sedazione.
In un precedente articolo dal nostro gruppo sulla genetica della sensibilità etanolo e rtolleranza APID in Drosophila, un test comportamentale basato su etanolo sedazione vapore indotta di mosche è stato utilizzato 18. Test in questo test è stato avviato con il trasferimento dal vivo adulti vola senza anestesia svuotare fiale alimentari, intrappolando le mosche nelle fiale con una spina di acetato di cellulosa, aggiungendo etanolo verso l'alto (cioè, lato non volo) del tappo di acetato di cellulosa, e sigillare la fiala contenente mosche, spina acetato di cellulosa e di etanolo con un tappo di silicone (vedi schema in Figura S3, riferimento 18). Più fiale che rappresentano diversi gruppi di mosche sono state valutate in parallelo, aumentando la velocità di questo test. Fiale sono stati dati un codice anonimo e sperimentatori sono stati accecati per gruppo di trattamento per prevenire la distorsione intenzionale nella valutazione della sedazione. In un esperimento standard mosche in fiale erano picchiettare leggermente ad intervalli di 6 min e, dopo un recupero di 30 secondi, il numero di mosche sedati in ogni flacone è stato contato e converted per cento mosche attivi. Mosche assorbiti vapori di etanolo dal tappo di acetato di cellulosa in modo dipendente dal tempo, causando un aumento progressivo in etanolo interno 18 e sedazione (riferimento cf 18 e Figure 1A e 1B in questo rapporto). La sedazione in questo test è stato operativamente definita come mosche (i) in piedi in assenza di camminare o (ii) che giace sulla schiena, con o senza sbattere le ali. Qui, questo dosaggio etanolo sedazione è descritta in dettaglio, ulteriore ottimizzazione operativa che riguardano l'uso è previsto, e il test viene utilizzato per indirizzare il contributo delle opzioni integrazione alimentare sulla sensibilità fly sedazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Test semplice che riproducibile quantificare fenotipi significativi sono di grande valore per l'analisi del comportamento. Il lavoro qui descritto affronta diversi aspetti pratici di un test per misurare la sensibilità etanolo sedazione e tolleranza rapida in Drosophila. Sebbene non sia un obiettivo di questo lavoro, analisi comportamentali sono facilitate mantenendo l'ambiente e lo sfondo costante genetico per soggetti di prova all'interno di uno studio. Inoltre, i confronti dovrebbero generalment…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were supported by grants from the National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse to M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). The authors thank Jill Bettinger for helpful discussions and Jacqueline DeLoyht for technical assistance.
Materials
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
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