Ex Utero electroporación y organotípicos rebanada Cultura de ratón Hipocampo Tissue

El hipocampo desempeña un papel importante en la memoria y el aprendizaje, así como el comportamiento emocional. Una función principal consiste en la consolidación de la memoria a corto plazo en memoria a largo plazo, lo que requiere una alta plasticidad del sistema nervioso. El giro dentado del hipocampo actúa como puerta de entrada principal de información de entrada y es también una de las dos regiones del cerebro con la neurogénesis continua a lo largo de la edad adulta ^1,2. El desarrollo de la estructura del hipocampo se produce durante la embriogénesis tardía y en particular durante los primeros 3 a 4 semanas después del parto ^3. Durante el desarrollo temprano de la circunvolución dentada de un grupo de células madre está establecido requiere para postnatal, así como la neurogénesis adulta ^4. Las neuronas en desarrollo pasan a través de diversas etapas, desde la célula madre a través de varias etapas de células progenitoras a los inmaduros y, finalmente, la neurona madura durante postnatal así como la neurogénesis adulta. En diferentes etapas de la neurogénesis la expresión degenes específicos se requiere para permitir la maduración y la integración de nuevas neuronas en los circuitos del hipocampo ^5,6.

Usando la genética del ratón y análisis de fenotipo por inmunohistoquímica así como los métodos moleculares permitió definir el patrón de expresión y la función de muchos de estos genes. Además el análisis de microarrays, así como la cromatina immunoprecipitation (CHIP) proporcionado información sobre posibles genes diana directos e indirectos ^7,8. Sin embargo, todavía hay muchas preguntas abiertas acerca de los mecanismos de regulación del desarrollo del hipocampo, en particular el desarrollo del giro dentado. Para obtener una mayor comprensión de cómo los genes específicos se regulan un sistema es necesario permitir la manipulación de un pequeño número de células por abajo o sobre regulación del gen de interés y / o de sus genes diana y seguir su destino durante el desarrollo. En electroporación in utero de shRNAs, cDNA de genes de interés o Cre recombinase proporciona una herramienta de este tipo. Para asegurar la presencia del ADN deseado o ARNs pequeños plásmidos de expresión se debe utilizar para la electroporación. Este enfoque se implementa con mucho éxito en el estudio del desarrollo cortical ^9,10, pero es un enfoque más difícil examinar el desarrollo de la circunvolución dentada debido a la posición de las estructuras del hipocampo en las capas más profundas del cerebro.

Electroporación utero Ex seguido por cultivo de cortes organotípicos es un enfoque para evitar este problema ^11,12. En contraste con la electroporación en el útero no todo el embrión, pero sólo la cabeza se utiliza permitiendo por lo tanto para colocar los electrodos de una manera más favorable para dirigir el shRNA / ADN hacia el hipocampo y la circunvolución dentada. Nuestro grupo emplea con éxito fuera del útero de la electroporación para estudiar el papel del factor de transcripción Bcl11b durante el desarrollo del giro dentado ^8. Bcl11b tiene un doble papel en el desarrollo giro dentado por regulating proliferación de células progenitoras, así como la diferenciación como quedó demostrado por inmunohistoquímica. Para definir además un mecanismo para la participación Bcl11b en estos procesos, protocolos del grupo Polleux ^11,12 se ajustaron para estudiar la circunvolución dentada como se describe a continuación en la sección de protocolo. En una primera aproximación a la cuestión se abordó si Bcl11b está regulando la diferenciación celular de las células neuronales de forma autónoma. Un segundo enfoque examinó si Desmoplakin, un gen diana directa de Bcl11b, es suficiente para rescatar el fenotipo Bcl11b.