Экс Utero электропорации и Органотипической фрагмент Культура мыши ткани гиппокампа

Гиппокамп играет важную роль в памяти и обучения, а также эмоциональное поведение. Один основная функция состоит в консолидации кратковременной памяти в долговременную память, которая требует высокой пластичности нервной системы. Зубчатая извилина гиппокампа выступает в качестве основного шлюза для ввода информации, а также один из двух областей мозга с постоянной нейрогенеза в течение взрослой жизни ^1,2. Развитие гиппокампа структуры происходит во время позднего эмбриогенеза и особенно в течение первого 3 до 4 недель послеродового ^3. Во время раннего развития зубчатой ​​извилине пул стволовых клеток, учрежденного требуется для послеродового а также нейрогенез ^4. Развивающиеся нейроны пройти через различные этапы, из стволовой клетки через несколько этапов клеток-предшественников в незрелые и, наконец, зрелого нейрона во время послеродового а также нейрогенез. На разных этапах нейрогенеза экспрессияспецифические гены требуется, чтобы созревание и интеграции новых нейронов в гиппокампе схемы ^5,6.

Использование генетику мыши и анализ фенотипа с помощью иммуногистохимии, а также молекулярные методы позволили определить характер экспрессии и функции многих из этих генов. В дополнение анализа микрочипов, а также иммунопреципитации хроматина (чип) представил информацию о потенциальных прямых и косвенных генов-мишеней ^7,8. Тем не менее, есть еще много открытых вопросов, касающихся механизмов регуляции гиппокампа развития, в частности развития зубчатой ​​извилины. Чтобы получить более глубокое представление, как специфические гены регулируются систему требуется позволяя манипулировать небольшим количеством клеток ВНИЗ или повышающей регуляции гена интереса и / или его генов-мишеней и следить за их судьбу во время разработки. Внутриутробное электропорации из shRNAs, кДНК генов интересов или Cre рекомбинацииSE обеспечивает такой инструмент. В целях обеспечения присутствия плазмиды экспрессии нужной ДНК или малых РНК должны использоваться для электропорации. Этот подход очень успешно применяется в изучении развития коры ^9,10, но более сложные подходы, изучения развития зубчатой ​​извилине из-за позиции гиппокампа структур в более глубоких слоях мозга.

Экс маточно электропорации с последующим органотипической культуры среза, является одним из подходов, чтобы обойти эту проблему ^11,12. В отличие от внутриутробного электропорации не весь эмбриона, но только головка используется позволяя таким образом, чтобы поместить электроды в более выгодном образом, чтобы направить shRNA / ДНК в сторону гиппокампа и зубчатой ​​извилины. Наша группа успешно применяются экс внутриутробно электропорации для изучения роли фактора транскрипции Bcl11b во зубчатой ​​развития извилины ^8. Bcl11b имеет двойную роль в зубчатой ​​извилине развития на гegulating пролиферацию клеток-предшественников, а также дифференцировку как было показано с помощью иммуногистохимии. Для дальнейшего определения механизма участия Bcl11b в этих процессах, протоколы группы Polleux ^11,12 доводили до изучения зубчатой ​​извилине, как описано ниже в разделе протокола. В первом приближении вопрос был рассмотрен Bcl11b регулирует ли нейронов дифференциации клеток клеточно автономно. Второй подход рассматривается ли Desmoplakin, непосредственным объектом ген Bcl11b, достаточно, чтобы спасти фенотип Bcl11b.