Вопрос о том, хроматина регуляторы и хроматина государства влиять на геном в естественных условиях является ключевым для понимания того, как рано судьбы клеток решения принимаются в развивающемся эмбрионе. Чип-Seq-самый популярный подход к расследованию функции хроматина на глобальном уровне, что изложенные здесь для эмбрионов Xenopus.
The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and organ formation during development. Determining the locations and levels of such chromatin features in vivo will provide valuable information about the spatio-temporal regulation of genomic elements, and will support aspirations to mimic embryonic tissue development in vitro. The most commonly used method for genome-wide and high-resolution profiling is chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-Seq). This protocol outlines how yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus can be processed for ChIP-Seq experiments, and it offers simple command lines for post-sequencing analysis. Because of the high efficiency with which the protocol extracts nuclei from formaldehyde-fixed tissue, the method allows easy upscaling to obtain enough ChIP material for genome-wide profiling. Our protocol has been used successfully to map various DNA-binding proteins such as transcription factors, signaling mediators, components of the transcription machinery, chromatin modifiers and post-translational histone modifications, and for this to be done at various stages of embryogenesis. Lastly, this protocol should be widely applicable to other model and non-model organisms as more and more genome assemblies become available.
The first attempts to characterize protein-DNA interactions in vivo were reported about 30 years ago in an effort to understand RNA polymerase-mediated gene transcription in bacteria and in the fruit fly1,2. Since then, the use of immunoprecipitation to enrich distinct chromatin features (ChIP) has been widely adopted to capture binding events and chromatin states with high efficiency3. Subsequently, with the emergence of powerful microarray technologies, this method led to the characterization of genome-wide chromatin landscapes4. More recently, chromatin profiling has become even more comprehensive and high-resolution, because millions of co-immunoprecipitated DNA templates can now be sequenced in parallel and mapped to the genome (ChIP-Seq)5. As increasing numbers of genome assemblies are available, ChIP-Seq is an attractive approach to learn more about the genome regulation that underlies biological processes.
Here we provide a protocol to perform ChIP-Seq on yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus. Drafts of the genomes of both widely used Xenopus species—X. tropicalis and X. laevis—have now been released by the International Xenopus Genome Consortium6. The embryos of Xenopus species share many desirable features that facilitate and allow the interpretation of genome-wide chromatin studies, including the production of large numbers of high-quality embryos, the large size of the embryos themselves, and their external development. In addition, the embryos are amenable to classic and novel manipulations like cell lineage tracing, whole-mount in situ hybridisation, RNA overexpression, and TALEN/CRISPR-mediated knockout technology.
The following protocol builds on the work of Lee et al., Blythe et al. and Gentsch et al.7-9. Briefly, Xenopus embryos are formaldehyde-fixed at the developmental stage of interest to covalently bind (cross-link) proteins to their associated genomic DNA. After nuclear extraction, cross-linked chromatin is fragmented to focus subsequent sequencing on specific genomic binding or modification sites, and to minimize the contributions of flanking DNA sequences. Subsequently, the chromatin fragments are immunoprecipitated with a ChIP-grade antibody to enrich those containing the protein of interest. The co-immunoprecipitated DNA is stripped from the protein and purified before creating an indexed (paired-end) library for next-generation sequencing (NGS). At the end, simple command lines are offered for the post-sequencing analysis of ChIP-Seq data.
Наш протокол описывает, как сделать и анализировать генома хроматина профили из эмбрионов Xenopus. Она охватывает каждый шаг от сшивающих белков эндогенного локусов в естественных условиях к обработке миллионы читает, представляющий обогащенные геномных участков в кремнии. Поскольку увеличение числа геномов проектов доступны, этот протокол должен быть применим к другой модели и не модельных организмов. Наиболее важный экспериментальный раздел, который устанавливает этот протокол отдельно от предыдущей работы 8,31,33,34, является процедура после фиксации, чтобы извлечь сшитые ядра. Это способствует эффективному хроматина солюбилизации и резки и легкий растяжение. Вместе с улучшенными эффективности библиотечной подготовки этого протокола позволяет строить очень сложные чип-Seq библиотеки от половины до двух миллионов клеток, экспрессирующих хроматина, ассоциированных эпитоп. Для чип-КПЦР экспериментов, несколько десятков тысяч этих клеток обычно достаточнодля проверки обогащения ДНК, возможно, на шесть различных геномных локусов. Эти цифры консервативные оценки, но может варьироваться в зависимости от уровня экспрессии белка, качества антител, сшивания эффективности и эпитоп доступности. В качестве ориентира, один Xenopus эмбрионов содержит около 4000 клеток на стадии среднего бластулы (8,5 после Nieuwkoop и Faber 29), 40000 клеток на стадии поздней гаструлы (12) и 100000 клеток на ранней стадии tailbud (20).
Точное время фиксации для эффективного иммунопреципитацией должна быть определена опытным путем чип-КПЦР (раздел 10). В общем, более длительные времена фиксации необходимы, если эксперимент предусматривает X. Laevis эмбрионов, на ранних стадиях развития, а также слабые (или косвенные) ДНК свойства. Тем не менее, это не рекомендуется фиксации Xenopus эмбрионов больше, чем 40 мин, или обработку больше, чем указано эмбрионов (раздел 3), а хроматина сдвига становится менее эффективным. Важно неиспользовать любой глицин после фиксации как этого общего шага для тушения формальдегид может сделать ядерную извлечение из богатых желтком зародышей очень трудно. В настоящее время причина этого не известна. Можно предположить, что формальдегид-глицин аддукт дополнительно реагирует с N-концевой амино-группы или остатки аргинина 35.
Антитела является ключом к любой ChIP эксперимента и достаточные контроля должны быть выполнены, чтобы показать свою специфику для эпитопа (см руководящих принципов Landt и др. 36). Если не ЧИП-класса антитела отсутствуют, внедрение соответствующих эпитопов с метками слитые белки могут быть законными альтернативой, поскольку эти белки могут занимать эндогенный сайты связывания 37. В этом случае, неинъецированных эмбрионы лучше всего использовать в качестве отрицательного контроля, а не чип с неспецифической сыворотки. Эта стратегия может также применяться, если интересующий белок экспрессируется на низком уровне, в результате плохой восстановления ENRIКВО ДНК.
Что касается решений чип-Seq библиотеки, из-за низкого количества ДНК в использовании, рекомендуется сделать выбор в пользу процедур, которые уменьшают количество ступеней очистки и объединяют реакции, чтобы какой-либо потери ДНК как минимум. Адаптеры и праймеры должны быть совместимы с мультиплексной последовательности и платформы NGS (табл конкретных материалов / оборудования). При использовании Y-адаптеры (содержащие длинные одноцепочечные руки), очень важно, чтобы предварительно усилить библиотека с 4:57 раундов ПЦР до размера, выбрав ДНК-вставок (например., От 100 до 300 б.п.) с помощью гель-электрофореза. Одноцепочечные концы привести фрагменты ДНК мигрировать гетерогенно. Испытание выполняется с различными количествами входного ДНК (например, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 и 20 нг), рекомендуется, чтобы определить общее количество циклов ПЦР (меньше или равно 18 циклов) требуется, чтобы размер -selected библиотека от 100 до 200 нг. Уменьшение количества циклов ПЦР оказывает секвенирование Редуndant читает менее вероятным. Твердые фазы обратимые иммобилизации шарики хорошо очистки реагентов эффективно восстановить интерес ДНК и надежно удалить любые свободные адаптеры и димеры перевязки и ПЦР-реакций.
С точки зрения количества, типа и длины читает, вокруг 20 до 30 млн одностороннего читает 36 б.п. достаточно для большинства чип-Seq экспериментов, чтобы покрыть всю Xenopus геном с достаточной глубиной. Наиболее распространенные машины NGS являются обычно способны удовлетворить этим критериям. Тем не менее, это может быть выгодно, чтобы увеличить количество операций чтения, если широкие распределения считывает ожидается, как это наблюдалось при модификации гистонов, а не резких пиков. Для многих чип-Seq экспериментов, от 4 до 5 по-разному индексированные библиотеки могут быть объединены и упорядочены в переулке один поток клеток с использованием высокопроизводительного NGS машину. Иногда также целесообразно увеличить длину считывания и последовательность обоих концах ДНК-матрицы (в паре-конец), чтобы увеличить mappability маскурица анализа хроматина в повторяющихся областей генома.
Этот протокол был успешно применен к широкому кругу функций хроматина, таких как факторы транскрипции, сигнализации посредников и посттрансляционных модификаций гистонов. Тем не менее, эмбрионы приобрести увеличивающуюся степень клеточной гетерогенности, как они развиваются и профили хроматина становится все труднее интерпретировать. Перспективные шаги были сделаны в Arabidopsis и дрозофилы тканевые специфически профиль хроматина ландшафтов путем извлечения типоспецифические клеточных ядер 38,39. Наш протокол включает в себя этап ядерного добычу, которая может проложить путь для тканеспецифической чип-Seq в других эмбрионов.
The authors have nothing to disclose.
We thank Chris Benner for implementing the X. tropicalis genome (xenTro2, xenTro2r) into HOMER and the Gilchrist lab for discussions on post-sequencing analysis. I.P. assisted the GO term analysis. G.E.G and J.C.S. were supported by the Wellcome Trust and are now supported by the Medical Research Council (program number U117597140).
1/16 inch tapered microtip | Qsonica | 4417 | This microtip is compatible with Sonicator 3000 from Misonix and Q500/700 from Qsonica. |
8 ml glass sample vial with cap | Wheaton | 224884 | 8 ml clear glass sample vials for aqueous samples with 15-425 size phenolic rubber-lined screw caps. |
Adaptor | IDT or Sigma | NA | TruSeq universal adaptor,
AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTCTTTCCCTACAC GACGCTCTTCCGATC*T. TruSeq indexed adaptor, P-GATCGGAAGAGCACACGTC TGAACTCCAGTCAC ‐NNNNNN‐ ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCTT*G. *, phosphorothioate bondphosphate group at 5' end. NNNNNN, index (see TruSeq ChIP Sample Preparation Guide for DNA sequence). Order adaptors HPLC purified. Adaptors can be prepared by combining equimolar amounts (each 100 µM) of the universal and the indexed adaptor and cooling them down slowly from 95 °C to room temperature. Use 1.5 pmol per ng of input DNA. Store at -20 °C. |
b2g4pipe (software) | Blast2GO | non-commercial | http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip |
BLAST+ (software) | Camacho et al. | non-commercial | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs&DOC_TYPE=Download |
Bowtie (software) | Langmead et al. | non-commercial | http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml |
cisFinder (software) | Sharov et al. | non-commercial | http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/ |
Chip for capillary electrophoresis | Agilent Technologies | 5067-1504 | Load this chip with 1 µl DNA for library quality control. Store at 4 °C. |
Chip-based capillary electrophoresis system | Agilent Technologies | G2940CA | The Agilent 2100 BioAnalyzer is used to check the quality of ChIP-Seq libraries. Keep reagents at 4 °C. |
ChIP-Seq library preparation kit (KAPA Hyper Prep Kit) | Kapa Biosystems | KK8504 | Kit contains KAPA end repair and A-tailing enzyme mix, end Repair and A-tailing buffer, DNA ligase, ligation buffer, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X), and KAPA library amplification primer mix (10X) (see also PCR primers). Adaptors are not included. Store at -20 °C. |
ChIP-Seq library preparation kit (alternative, ThruPLEX-FD Prep Kit) | Rubicon Genomics | R40048 | Kit uses their own stem-loop adaptors and primers. This kit eliminates intermediate purification steps and is as sensitive as the KAPA Hyper Prep Kit. Store at -20 °C. |
Cluster3 (software) | de Hoon et al. | non-commercial | http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster |
FastQC (software) | Simon Andrews | non-commercial | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc |
Fluorometer | life technologies | Q32866 | Qubit 2.0 Fluorometer |
Fluorometer reagents | life technologies | Q32851 | The kit provides concentrated assay reagent, dilution buffer, and pre-diluted DNA standards for the Qubit fluorometer. Store DNA standards at 4 °C, buffer and dye at room temperature. |
Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | Formaldehyde solution, for molecular biology, 36.5-38% in H2O, stabilised with 10-15% methanol. Store at room temperature. CAUTION: Formaldehyde is corrosive and highly toxic. |
Gel (E-Gel EX agarose , 2%) | life technologies | G4010 | Pre-cast gel with 11 wells, openable format. Leave one lane between ladder and library empty to avoid cross-contamination. Store gels at room temperature. |
Gel electrophoresis system | life technologies | G6465 | E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager combo kit for size-selecting ChIP-Seq libraries. |
Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | Store all reagents at room temperature. Use 500 µl of QG buffer per 100 mg of 2% agarose gel slice to extract DNA. Use MinElute columns (from MinElute PCR purification kit) to elute DNA twice. |
HOMER (software) | Chris Benner | non-commercial | http://homer.salk.edu/homer/index.html |
Hybridization oven | Techne | FHB1D | Hybridizer HB-1D |
IGV (software) | Robinson et al. | non-commercial | http://www.broadinstitute.org/igv/home |
Illumina CASAVA-1.8 quality filter (software) | Assaf Gordon | non-commercial | http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter |
Java TreeView (software) | Alok Saldanha | non-commercial | http://jtreeview.sourceforge.net |
Laboratory jack | Edu-Lab | CH0642 | This jack is used to elevate sample in sound enclosure for sonication. |
Ladder, 100 bp | New England BioLabs | N3231 | Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 °C. |
Ladder, 1 kb | New England BioLabs | N3232 | Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 °C. |
Low-retention 1.5-ml microcentrifuge tubes | life technologies | AM12450 | nonstick, RNase-free microfuge tubes, 1.5 ml |
MACS2 (software) | Tao Liu | non-commercial | https://github.com/taoliu/MACS |
Magnetic beads | life technologies | 11201D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-mouse IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
Magnetic beads | life technologies | 11203D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-rabbit IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
Magnetic beads | life technologies | 10001D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein A covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
Magnetic beads | life technologies | 10003D | These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein G covalently bound to the bead surface. Store at 4 °C. |
Magnetic rack | life technologies | 12321D | DynaMag-2 magnet |
MEME | Bailey et al. | non-commercial | http://meme.nbcr.net/meme/ |
Na3VO4 | New England BioLabs | P0758 | Sodium orthovanadate (100 mM) is a commonly used general inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. Store at -20 °C. |
NaF | New England BioLabs | P0759 | Sodium fluoride (500 mM) is commonly used as general inhibitor of phosphoseryl and phosphothreonyl phosphatases. Store at -20 °C. |
NGS machine | Illumina | SY-301-1301 | Genome Analyzer IIx |
NGS machine (high performance) | Illumina | SY-401-2501 | HiSeq |
Normal serum (antibody control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2028 | Use as control for goat polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C. |
Normal serum (antibody control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | Use as control for mouse polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C. |
Normal serum (antibody control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | Use as control for rabbit polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 °C. |
Nucleic acid staining solution | iNtRON | 21141 | Use RedSafe nucleic acid staining solution at 1:50,000. Store at room temperature. |
Orange G | Sigma | O3756-25G | 1-Phenylazo-2-naphthol-6,8-disulfonic acid disodium salt. Store at 4 °C. |
PCR primers | e.g., IDT or Sigma | NA | Primers to enrich adaptor-ligated DNA fragments by PCR: AATGATACGGCGACCACCGA*G and CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, phosphorothioate bond. Primers designed by Ethan Ford. Combine primers at 5 µM each. Use 5 µl in a 50 µl PCR reaction. Store at -20 °C. |
MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28006 | for purification of ChIP-qPCR and shearing test samples. Store MinElute spin columns at 4 °C, all other buffers and collection tubes at room temperature. |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1, pH 7.9) | life technologies | AM9730 | Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) is premixed and supplied at pH 6.6. Use provided Tris alkaline buffer to raise pH to 7.9. Store at 4 °C. CAUTION: phenol:chloroform:isoamyl alcohol is corrosive, highly toxic and combustible. |
Primer3 (software) | Steve Rozen & Helen Skaletsky | non-commercial | http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi |
Protease inhibitor tablets | Roche | 11836170001 | cOmplete, Mini, EDTA-free. Use 1 tablet per 10 ml. Store at 4 °C. |
Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free. Use 1 tablet per 50 ml. Store at 4 °C. |
Proteinase K | life technologies | AM2548 | proteinase K solution (20 µg/µl). Store at -20 °C. |
RNase A | life technologies | 12091-039 | RNase A (20 µg/µl). Store at room temperature. |
Rotator | Stuart | SB3 | Rotator SB3 |
SAMtools (software) | Li et al. | non-commercial | http://samtools.sourceforge.neta |
Solid phase reversible immobilisation beads | Beckman Coulter | A63882 | The Agencourt AMPure XP beads are used to minimise adaptor dimer contamination in ChIP-Seq libraries. Store at 4 °C. |
Sonicator 3000 | Misonix/Qsonica | NA | Newer models are now available. Q125, Q500 or Q700 are all suitable for shearing crosslinked chromatin. |
Sound enclosure | Misonix/Qsonica | NA | optional: follow the manufacturer's recommendation to obtain the correct sound enclosure. |
Thermomixer | eppendorf | 22670000 | Thermomixer for 24 x 1.5 mL tubes. Precise temperature control from 4 °C above room temperature to 99 °C. |